Neiegkeeten

Merci fir besicht Nature.com.D'Browser Versioun déi Dir benotzt huet limitéiert CSS Ënnerstëtzung.Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech en aktualiséierte Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten).An der Tëschenzäit, fir weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, wäerte mir de Site ouni Stiler a JavaScript maachen.
Kriibszellen hu verschidde Mechanismen evoluéiert fir de celluläre Stress ze iwwerwannen a weider ze progresséieren.Proteinkinase R (PKR) a säi Proteinaktivator (PACT) sinn déi initial Äntwerten déi verschidde Stresssignaler iwwerwaachen, déi zu der Inhibitioun vun der Zellproliferatioun an der Apoptose féieren.Allerdéngs bleift d'Regulatioun vun der PACT-PKR Passerelle zu Kriibs Zellen gréisstendeels onbekannt.Hei hu mir festgestallt datt laang net-kodéierend RNA (lncRNA) aspartyl tRNA-Synthetase-Antisense RNA 1 (DARS-AS1) direkt an der Inhibitioun vum PACT-PKR-Wee involvéiert ass a Kriibszellproliferatioun fördert.Mat grousser Skala funktionell Duerchmusterung vun CRISPRI 971 Kriibs-assoziéiert lncRNA, hu mir festgestallt datt DARS-AS1 mat wesentlech verstäerkter Kriibszellproliferatioun assoziéiert ass.Dofir hemmt DARS-AS1 Knockout d'Zellverbreedung a fördert Kriibszellapoptose a verschiddene Kriibszelllinnen in vitro a reduzéiert de Tumorwachstum in vivo wesentlech.Mechanesch bindet DARS-AS1 direkt un de PACT Aktivéierungsdomän a verhënnert d'PACT-PKR Interaktioun, doduerch d'PKR Aktivatioun, d'eIF2α Phosphorylatioun ze reduzéieren an den apoptoteschen Zell Doud ze hemmen.Klinesch ass DARS-AS1 wäit a multiple Kriibs ausgedréckt, an Iwwerexpressioun vun dësem lncRNA ass indikativ fir eng schlecht Prognose.Dës Studie beliicht Kriibsspezifesch Regulatioun vum PACT-PKR Wee duerch DARS-AS1 lncRNA a bitt en anert Zil fir Kriibsprognose a Behandlung.
D'Fäegkeet sech un Stress unzepassen ass e wichtege Charakteristik vum Kriibszell Iwwerliewe a Verbreedung.Déi séier Verbreedung a metabolesch Markenzeeche vu Kriibs Peak an haarde Mikroëmfeld - Nährstoffdeprivatioun, Hypoxie a nidderegen pH - dat kann Zell Doud Signalweeër ausléisen.Dysregulatioun vu stressempfindleche Genen wéi p535, Hëtztschockproteine ​​6, 7, KRAS8, 9, an HIF-110, 11, 12, 13 gëtt dacks a Kriibs beobachtet, doduerch d'Apoptose blockéiert an d'Iwwerliewe fördert.
Proteinkinase R (PKR) ass e wichtege Stresssensor an Ënnerunitéitkinase vum eukaryoteschen Initiatiounsfaktor 2α (eIF2α), en Iwwersetzungsregulator deen celluläre Stress mam Zell Doud verbënnt.PKR gouf ursprénglech als antiviral Protein identifizéiert duerch d'Detektioun vun engem auslänneschen duebelstrengegen RNA (dsRNA).No der Aktivatioun phosphoryléiert PKR eIF2α fir viral a cellulär Proteinsynthese14,15,16 ze hemmen.PACT (PKR Aktivator Protein) gouf als den éischte PKR Aktivator Protein an der Verontreiung vu dsRNA17,18,19,20,21,22,23 identifizéiert.Duerch direkt Interaktioun mat PKR transducéiert PACT verschidde Spannungen (Serumhonger, Peroxid- oder Arsenitbehandlung) op PKR a Downstream Signalweeër.Zousätzlech zu der eIF2α Phosphorylatioun, PACT-mediéiert PKR Aktivatioun ausléist verschidde Eventer verbonne mat der Stressreaktioun, inklusiv geännerten Redoxstatus iwwer de PI3K / Akt24 Wee, verstäerkte DNA Schued Iwwerpréiwung iwwer p5325,26 an NF-κB27,28 Reguléiert Transkriptioun, 29. Wéinst hirer kritescher Roll bei der Stressreaktioun, der Verbreedung, der Apoptose an aner Schlësselzelluläre Prozesser, PKR a PACT si villverspriechend therapeutesch Ziler fir vill Krankheeten, besonnesch Kriibs30,31,32,33.Allerdéngs, trotz dëser pleiotropic funktionell a biologescher Bedeitung, bleift d'Regulatioun vun PACT /PKR Aktivitéit zu Kriibs Zellen elusive.
lncRNAs sinn Transkriptiounen méi grouss wéi 200 Nukleotiden ouni Proteinkodéierungspotenzial.Zënter opzedeelen ganz Genom Sequenzéierungsprojeten hunn Dausende vun lncRNAs identifizéiert,35,36 vill Effort gouf gemaach fir hir biologesch Funktiounen z'erklären.E wuessende Kierper vu Fuerschung huet gewisen datt lncRNAs a ville biologesche Prozesser involvéiert sinn37 dorënner d'Regulatioun vun der X-Chromosom Inaktivéierung38,39, Imprinting40, Transkriptioun41,42, Iwwersetzung43 a souguer Kriibswachstum44,45,46,47.Dës Studie berichten datt vill lncRNAs am PACT /PKR Passerelle involvéiert sinn.Eng esou Studie huet gewisen datt lncRNA ASPACT PACT Transkriptioun hemmt an d'Nuklearretentioun vu PACT mRNA erhéicht huet.Aner Studien hu gewisen datt lncRNA nc886 un PKR bindt a seng Phosphorylatioun hemmt49,50.Bis elo ass lncRNA déi PACT-mediéiert PKR Aktivatioun reguléieren net gemellt ginn.
Aspartyl-tRNA Synthetase Antisense RNA 1 (DARS-AS1) gouf als oncogen lncRNA51,52,53,54 identifizéiert.Duerch d'Reguléierung vu miP-194-5p53, miP-12952 a miP-532-3p51, gouf DARS-AS1 gewisen fir de Wuesstum vu kloren Zell Nierenzellkarzinom, Schilddrüsekarzinom an net-klengzellen Lungenkarzinom ze förderen.Tong a Kollegen hunn och fonnt datt DARS-AS1 Myelom Progressioun fördert andeems d'Stabilitéit vum Protein 39 (RBM39) RNA-bindende Motiv erhale gëtt.Wéi och ëmmer, keng Studien goufen duerchgefouert ob dëst lncRNA an der Reguléierung vun der PACT-PKR Aktivatioun an der Stressreaktioun vu Kriibszellen involvéiert ass.
Hei hu mir e grousst-Skala Verloscht-vun-Funktioun Écran mat der CRISPRI System gemaach a festgestallt datt DARS-AS1 lncRNA d'Prolifératioun vu verschiddenen Aarte vu Kriibszellen fördert.Zousätzlech hu mir e grousse Mechanismus identifizéiert: DARS-AS1 bindt direkt un PACT, hemmt PACT a PKR Bindung, verhënnert d'Phosphorylatioun vun eIF2α, e méi nidderegen PKR Substrat, a schlussendlech hemmt den apoptoteschen Zell Doud.Als Conclusioun, weist eis Aarbecht der DARS-AS1 lncRNA als regulator vun der PACT-PKR Passerelle an e Potential Zil fir Kriibs Behandlung an hätt.
Extensiv genomesch Profilstudien hunn Honnerte vun lncRNAs mat Kriibs verbonne identifizéiert.Wéi och ëmmer, hir Funktioun bleift gréisstendeels onbekannt56.Fir villverspriechend lncRNA Kandidaten ze identifizéieren, déi am Kriibs Fortschrëtt involvéiert sinn, hu mir e Verloscht-vun-Funktioun Écran fir reduzéiert Verbreedung an der SW620 colorectal Kriibs Zell Linn mat der CRISPRi System gemaach (Figebam. 1a).Déi eenzegaarteg Feature vun den SW480 an SW620 Colon Kriibs Zell Linnen ass datt se aus primären a sekundären Tumoren an engem eenzege Patient ofgeleet ginn.Dëst bitt e wäertvolle Verglach fir d'Studie vun geneteschen Ännerungen am Fortschrëtt vu fortgeschratten Darmkrebs.Dofir, analyséiert mir d'transcriptomes vun colorectal Kriibs Zell Linnen (SW480 an SW620) RNS sequencing benotzt a gesammelt e puer potenziell funktionell lncRNAs aus der publizéiert Literatur.Baséierend op dëse Resultater, entworf mir eng zesummegefaasst sgRNA Bibliothéik mat 7355 sgRNA Oligos gezielt 971 Kriibs-assoziéiert lncRNAs an 500 untargeted sgRNA Oligos fir eng negativ Kontroll (Ergänzungsdaten 1).
Schematesch Representatioun vum Screening mam CRISPRi System.b sgRNA Beräicherung no Duerchmusterung.Déi horizontal gestierzt Linn representéiert log2 (falsch Ännerung) = ± 0,58.Déi vertikal Punktelinn weist p Wäert = 0,05.Schwaarz Punkte representéieren net-Zil-sgRNA (als NC bezeechent).Roude Punkte si sgRNAs déi DARS-AS1 zielen.Blo Punkte si sgRNAs, déi LINC00205 zielen, e virdru beschriwwe onkogene lncRNA.klappt änneren = (normaliséiert Liesung, Dag 17)/(normaliséiert Liesung, Dag 0).c DARS-AS1 sgRNA knockdown hemmt Zellwachstum.Feeler Baren representéieren ± Standarddeviatioun vun den dräi Experimenter.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 zwee-tailed Student d'T-Test.d DARS-AS1 Ausdrock an Tumoren (TCGA Dataset).em Ausdrock vun DARS-AS1 an gepaart normal an entholl Echantillon vun Patienten mat BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, an COAD, respektiv (TCGA Dataset).p-Wäerter goufen mat gepaart zwee-tailed Student T-Test kritt.
Nom Konstruktioun vum Plasmid an der Verpakung vum Lentivirus, hu mir d'dCas9-SW620 kolorektal Kriibszelllinn mat der uewe genannter Bibliothéik a véier onofhängeg Infektiounsexperimenter transduced.D'Multipliziitéit vun der Infektioun (MOI) fir dës Infektiounen war 0,1-0,3, wat beweist datt all Zell nëmme mat engem sgRNA transfektéiert ka ginn.No 18 Deeg vun der In-vitro-Kultur ass d'Beräicherungsprofil vun Zil-sgRNAs no der Screening erofgaang oder eropgaang, während d'Zuel vun net-geziilten Kontrolloligonukleotiden relativ onverännert bliwwen ass am Verglach zum Pre-Screening-Profil, wat beweist datt eis Zil eng héich Écranspezifesch huet. Bibliothéik.Reis.1b an Ergänzungstabell 1). LINC00205, déi virdru gemellt gouf fir Lungenkrebs a Liewerkriibsprogressioun58,59,60 ze förderen, gouf gepréift (log2 (foldchange) <-0,58, p Wäert <0,05), wat d'Zouverlässegkeet vun dësem Duerchmusterung bestätegt (Figebam. 1b). LINC00205, déi virdru gemellt gouf fir Lungenkrebs a Liewerkriibsprogressioun58,59,60 ze förderen, gouf gepréift (log2 (foldchange) <-0,58, p Wäert <0,05), wat d'Zouverlässegkeet vun dësem Duerchmusterung bestätegt (Figebam. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, virdru gemellt fir de Fortschrëtt vu Lungenkrebs a Liewerkriibs58,59,60 ze förderen, gouf ausgeschloss (log2 (falsch Ännerung) <-0.58, p-Wäert <0.05), bestätegt d'Robustheet vun dësem Duerchmusterung (Fig. .1b) . Linc00055 之前 之前 报道 促进 肺癌 和 和 肝癌 进展 进展8,59,60.5, 被 选 掉 掉 <-05 (倍数 值值 (倍数 可靠性值 (值 可靠性 可靠性值 (图 Linc00055 之前 之前 报道 促进 肺癌 和 和 肝癌 进展 进展8,59,60.5, 被 选 掉 掉 <-05 (倍数 值值 (倍数 可靠性值 (值 可靠性 可靠性值 (图 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, virdrun gemellt Otemschwieregkeeten an Liewer Kriibs progression58,59,60 ze förderen, war ausgeschloss (log2 (falsch änneren) <-0,58, p-Wäert <0,05), confirméiert der Robustheet vun dëser Duerchmusterung (Figebam. .1b).
Ënnert all getest lncRNAs, DARS-AS1 war och gescannt, mat den dräi kognate sgRNA oligonucleotides bedeitend reduzéiert no 18 Deeg vun Kultur, suggeréiert datt knockdown vun dëser lncRNA zu reduzéiert Kriibs Prolifératioun (Lalumi 1b).Dëst Resultat gouf weider ënnerstëtzt vun MTS Analyse an colorectal Kriibs Zellen weist, datt de Wuesstem Taux vun DARS-AS1 knockdown Zellen nëmmen halbéiert war am Verglach mat Kontroll Zellen (Dorënner 1c) a war konsequent mat virdrun Rapporte vun e puer aner Kriibs Zorte.: kloer Zell Nier Kriibs, Schild Kriibs an Net-kleng Zell Lungenkrebs51,52,53,55.Wéi och ëmmer, seng Funktioun a molekulare Mechanismen am Kolorektalkriibs bleiwen onerfuerscht.Dofir hu mir dëst lncRNA fir weider Etude gewielt.
Fir DARS-AS1 Ausdrock bei Patienten ze studéieren, analyséiert mir iwwergräifend 10.327 entholl Echantillon vum Cancer Genom Atlas (TCGA) Projet.Eis Resultater weisen datt DARS-AS1 wäit ausgedréckt a wesentlech upreguléiert ass a gesonden Zellen a ville Tumoren, dorënner Colon Adenocarcinom (COAD), Renal Clear Cell Carcinoma (KIRC), an Nierenpapillärzellkarzinom (KIRP)..Ganz wéineg (Fig. 1d an Zousaz Fig. 1a, b). Analyse vu gepaart gesonden / Tumor Echantillon bestätegt weider e wesentlech méi héije Ausdrock vun DARS-AS1 an den Tumoren vum Blase Urothelial Karzinom (BLCA), Nierenrenal Clear Cell Carcinoma (KIRC), Prostata Adenocarcinom (PRAD), Lunge squamous Zell Karzinom (LUSC) , Gebärmutterkorpus Endometriumkarzinom (UCEC), Lungenadenocarcinom (LUAD), Liewer Hepatozellulär Karzinom (LIHC), Nier Nierenpapillärzellkarzinom (KIRP), a Colon Adenocarcinom (COAD) (p Wäert <0,05) (Fig. 1e-m) . Analyse vu gepaart gesonden / Tumor Echantillon bestätegt weider e wesentlech méi héije Ausdrock vun DARS-AS1 an den Tumoren vum Blase Urothelial Karzinom (BLCA), Nierenrenal Clear Cell Carcinoma (KIRC), Prostata Adenocarcinom (PRAD), Lunge squamous Zell Karzinom (LUSC) , Gebärmutterkorpus Endometriumkarzinom (UCEC), Lungenadenocarcinom (LUAD), Liewer Hepatozellulär Karzinom (LIHC), Nier Nierenpapillärzellkarzinom (KIRP), a Colon Adenocarcinom (COAD) (p Wäert <0,05) (Fig. 1e-m) .Analyse vu gepaart gesonden / Tumor Echantillon bestätegt och wesentlech méi héich Ausdrock vun DARS-AS1 an der Blase urothelial Karzinom (BLCA), kloer Zell Nieren- an Nierzellkarzinom (KIRC), Prostataadenokarcinom (PRAD), Lunge Plateaukarzinom (LUSC) Tumoren., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m). , Endometriumkarzinom vum Corpus Uteri (UCEC), Adenokarcinom vun der Lunge (LUAD), Hepatozellulärer Leberkarzinom (LIHC), Papillärzellkarzinom vun der Nier (KIRP), an Adenokarzinom vum Colon (COAD) (p Wäert < 0,05) (Fig. 1e– m) .配对 健康 / 肿瘤样本 的 进 进进 证实 了 Däiwn-wéi1 在 在 尿路 皮癌 (Prac), 肿瘤肾 (Prac), 肿瘤肾 (Prac), 肿瘤肾 (Prac)显着 更 高 表达, 子宫体子宫 内膜 癌 (Ucec), 肺腺癌 (Luad), 肝肝 (lihc), 肾 细胞癌 (Cirp) (Pirp) <0.05) (图1e-m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤肿瘤 的的 的的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 肺腺癌 显着 显着 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 中 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 肺腺癌 细胞 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 肺腺癌 细胞 细胞 细胞 细胞 肺腺癌 细胞 肝肝 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 细胞 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 细胞 细胞 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 细胞 细胞 细胞 肺腺癌癌?癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m）.Analyse vu gesonde/tumor gepaart Echantillon ënnerstëtzt weider d'Roll vun DARS-AS1 an Blase urothelial carcinoma (BLCA), kloer Zell renal Zell carcinoma (KIRC), Prostata adenocarcinoma (PRAD), a Lunge squamous Zell carcinoma (LUSC) Tumoren.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). Ausdrock am Corpus Gebärmutterkarzinom (UCEC), Lungenadenocarcinom (LUAD), Hepatozellulär Karzinom (LIHC), Nierenpapillärzellkarzinom (KIRP), a Colon Adenocarcinom (COAD) (p Wäert <0,05) (Dorënner 1e -m).Zesummegefaasst weisen dës Resultater datt DARS-AS1 wäit an héich an enger Rei vu Kriibs ausgedréckt ass.
Well DARS-AS1 an DARS (de Gen, deen den Antisense Strang encodéiert) dee selwechte Promoteur deelen an nieftenee läit, hu mir shRNA entworf fir spezifesch DARS-AS1 ze knockdown awer net DARS (Ergänzungs Fig. 2a,b an Ergänzungstabell 2) .Zousätzlech zu SW620, hu mir och dräi aner Zelllinnen benotzt, déi DARS-AS1 ausdrécken, fir d'Effizienz an d'Funktioun vum shRNA Knockdown ze studéieren (Ergänzungstabell 3).Eis Resultater uginn, datt all dräi shRNAs entwéckelt erreecht op d'mannst 80% DARS-AS1 knockdown Effizienz mat wéineg Effekt op d'Quantitéit vun DARS mRNA (Ergänzlech Lalumi 2c-f).Zousätzlech hu mir festgestallt datt DARS-AS1 Knockdown mat dësen shRNAs däitlech den Zellwachstum an de kolorektale Kriibszelllinnen SW620 (49.7%) an HCT116 (27.7%), Broschtkriibszelllinn MBA-MD-231 (53.4%) hemmt.) an der HepG2 hepatoma Zell Linn (92,7% Reduktioun), wéi och hir Fähegkeet unanchored Sphär ze Form (Moyenne Reduktioun vun ~ 50,8%, 44,6%, 40,7% an 75,7% pro Zell Linn) (Lalumi 2a, b).An SW620, confirméiert d'Resultater vun der Kolonie Formatioun assay weider dass DARS-AS1 shRNA vill Zell Prolifératioun inhibited mat enger Moyenne Ofsenkung vun ongeféier 69,6% (Lalumi 2c).
Effekt vun der Kontroll shRNA an DARS-AS1 shRNA op Zell Prolifératioun (a) a Sphäroidbildung (b) an SW620, HCT116, MBA-MD-231, an HepG2 Zellen.c Effekt vu Kontroll shRNA an DARS-AS1 shRNA op Koloniebildung an SW620 Zellen.Zell Prolifératioun (d), Sphäroidbildung (e), a Koloniebildung (f) vun SW620 Zellen déi DARS-AS1 overexpresséieren.Donnéeën gewisen sinn der Moyenne ± Standard deviation vun dräi Experimenter.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, an *** p ≤ 0,001 duerch zwee-tailed Student d'T-Test.
Fir Verloscht-vun-Funktioun Studien ergänzen, hu mir nächst SW620 Zellen overexpressing DARS-AS1 erstallt (Ergänzlech Fig. 2g).DARS-AS1 Iwwerexpressioun bedeitend erhéicht Zellwachstum (1.8-Fold), onverankert Sphäroidbildung (1.4-Fold), a Koloniebildung (3.3-Fold) an SW620 Zellen (Fig. 2d-f).Mir bestätegt dëst Resultat mat enger anerer DARS-AS1 ausdréckend Zelllinn, A549.Dëst verstäerkte Zell Prolifératioun wéinst DARS-AS1 overexpression war weider an A549 Zellen observéiert (Ergänzlech Lalumi 2h, ech an Zousaz Table 3).Zesummegefaasst weisen dës Gewënn- a Verloschtstudien datt DARS-AS1 Kriibszellproliferatioun in vitro fördert.
Fir den ënnerierdesche Mechanismus z'entdecken, duerch deen DARS-AS1 d'Zellproliferatioun reguléiert, hu mir eng RNA Pull-Down Analyse gemaach fir seng potenziell Proteinbindende Partner z'identifizéieren.RT-qPCR Resultater weisen, datt ongeféier 86,2% vun DARS-AS1 am Zytoplasma vun SW620 Zellen läit (Ergänzlech Lalumi 3a).Déi kënschtlech transkribéiert biotinyléiert DARS-AS1 oder PseudoRNA gouf duerno mat SW620 Zelllysate inkubéiert, gefollegt vun der SDS-PAGE Trennung.Spéider Sëlwer staining gewisen, datt eng z'ënnerscheedde Band (~ 38 kDa) bedeitend an DARS-AS1 zéien Echantillon beräichert war awer net an dummy RNS oder Perlen Echantillon (Lalumi 3a).Dës Band gouf als PKR aktivéierend Protein (PACT) duerch Massspektrometrie (MS) identifizéiert a weider duerch Immunblotting an SW620, HCT116, an HepG2 Zelllinnen (Lalumi 3a, b) bestätegt.D'Beräicherung vun DARS a verwandte PACT Proteinen - PKR an TRBP - gouf och mat RNA Analyse duerch Western Blotting (WB) ënnersicht.D'Resultater uginn datt keng direkt Interaktioun tëscht DARS-AS1 RNS an dësen dräi Proteinen fonnt gouf (Ergänzlech Lalumi 3b).Déi spezifesch Interaktioun tëscht DARS-AS1 a PACT gouf weider duerch RNA Immunoprecipitatioun (RIP) Analyse bestätegt, déi gewisen huet datt DARS-AS1 wesentlech an Anti-PACT Antikörper beräichert war, awer net aner Kontroll RNAs (Dorënner 3c).Fir festzestellen ob DARS-AS1 direkt mat PACT interagéiert an der Verontreiung vun all aner cellulär Komponenten, gouf eng In vitro Biolayer Interferometrie (BLI) Assay mat gereinegt PACT gemaach.Biotin-Label DARS-AS1 oder Dummy RNA gouf op Streptavidin (SA) Biosensoren immobiliséiert an duerno an kinetesche Puffer inkubéiert mat 1 μM PACT.Notamment huet PACT staark un DARS-AS1 gebonnen (KD Wäert ~ 26.9 nM), awer net fir RNS ze mimikéieren (Dorënner 3d).Zesummegefaasst weisen dës Resultater eng direkt Interaktioun an héich Affinitéit tëscht DARS-AS1 a PACT.
RNA Pull Analyse identifizéiert DARS-AS1 interagéiert mat PACT an SW620 Zellen.Uewen, Sëlwerfaarf vu verwandte Proteinen.Ënneschten Immunoblots goufen mat Anti-PACT Antikörper gemaach.b RNS Pull-Down Analyse war an HCT116 (uewen) an HepG2 (ënnen) Zellen gesuergt.PACT Beräicherung war vun immunoblotting entdeckt.cRNA Immunoprecipitatioun (RIP) Assays goufen an SW620 Zellen duerchgefouert mat den uginnen Antikörper.d PACT bindend Kéiren op voll Längt DARS-AS1 oder Kontroll RNS goufen mat Biolayer Interferometry (BLI) kritt.RNA gouf op engem streptavidin Biosensor immobiliséiert.1 μM PACT gouf benotzt fir Associatioun ze moossen.e RNA Pull Assay gouf mat biotinyléierter Volllängt DARS-AS1 oder ofgeschnidden (uewen) gemaach.Immunoblot weist PACT kritt (ënneschten).f Purified flagged PACT war mat biotinylated voll Längt DARS-AS1 incubated oder ofgeschnidden (wéi an e) fir kënschtlech RIP Assay.D'ofgebaut RNS war vun RT-qPCR verifizéiert.g D'relativ Affinitéit vu verschiddene RNS Fragmenter fir PACT war mat biolayer interferometry kritt.Fir Analyse, goufen 100 nM RNS an 1 μM RAST benotzt.h In vitro RIP Assays goufen mat gereinegt intakt oder ofgeschnidden Label PACT gemaach.D'ofgebaut RNS war vun RT-qPCR verifizéiert.ech Wuesstem Taux vun SW620 Zellen overexpressing DARS-AS1, PACT, oder béid.j Overexpression vu voller Längt oder ofgeschnidden DARS-AS1 an SW620 Zellen haten verschidden Effekter op Zellwachstum.k Apoptosis gouf duerch immunoblotting mat Anti-PARP Antikörper festgestallt.l Knockout vun DARS-AS1 induzéiert Apoptose vun SW620 Zellen wéi duerch Flowzytometrie gewisen.Donnéeën gewisen sinn der Moyenne ± Standard deviation vun dräi Experimenter. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, duerch zwee-tailed Student's t Test. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, duerch zwee-tailed Student's t Test. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 duerch zwee-tailed Student's T-Test. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 duerch zwee-tailed Student's T-Test.
Mir generéiert dann dräi biotinylated DARS-AS1 RNS Fragmenter vun in vitro Transkriptiouns der DARS-AS1 Regioun néideg fir PACT Associatioun ze identifizéieren (Dorënner 3e).D'RNS Analyse Resultater weisen, datt all Fragment mat PACT ze interagéieren konnt, mä d'3'-Uschloss Regioun (384-768 Nukleotiden Label A3) huet méi wéi 1-384 Nukleotiden Label A1) (Lalumi 3e).Ähnlech Resultater goufen am in vitro RIP Assay mat rekombinante PACT observéiert (Dorënner 3f).Konsequent mat dëse Resultater, Experimenter fir immobiliséiert RNA Fragmenter un PACT mat BLI ze binden hunn och gewisen datt PACT eng méi héich Affinitéit fir A3 (384-768 nt) (KD Wäert vun ongeféier 94,6 nM) huet, wärend bal keng Linke mat anere Beräicher.(Fig. 3d).
Mir iwwerpréift och déi assoziéiert bindend Regiounen am PACT.PACT enthält dräi funktionell Domainen, vun deenen zwee konservéiert duebelstrengeg RNA-bindende Domainen (dsRBD) an en drëtten Domän (bezeechent D3) déi als Aktivator vu Proteininteraktiounen handelt.Fir d'lncRNA bindend Kapazitéit vun all Domain z'ënnersichen, hu mir dräi Mutatiounen entwéckelt, déi jiddereng vun den dräi Domainen ewechgeholl hunn an en in vitro RIP Assay gemaach hunn.Eis Resultater weisen datt d'Läschung vum drëtten Domain (D3) vum PACT wesentlech seng Interaktioun mat DARS-AS1 reduzéiert huet (duerch 0,11-Fold am Verglach mat intakt PACT) am Verglach mat den aneren zwou Mutatiounen (Figebam. 3h), et gouf gewisen datt d'Verëffentlechung vun D3 interagéiert mat DARS.-AC1.Zesummegefaasst suggeréieren dës Resultater datt d'Interaktioun tëscht DARS-AS1 a PACT haaptsächlech duerch den 3′ Enn vun DARS-AS1 an dem D3 Domain vu PACT ka geschéien.
Mir bemierken datt DARS-AS1 keen Effekt op PACT Ausdrock haten an PACT keen Effekt op DARS-AS1 huet (Ergänzlech Lalumi 3c).Mir hunn dunn den Effekt vum PACT Knockdown op Zellwachstum iwwerpréift.Am Géigesaz zu DARS-AS1 sinn relativ Zellen 1,5-3 Mol méi séier gewuess wann PACT erofgefall ass (Ergänzungs Fig. 3d).D'Resultater vun der Kolonie Formatioun assay uginn, datt d'Zellen geformt 2-3-fantastesch Kolonien no shRNA Behandlung mat PACT (Ergänzlech Lalumi 3e).Fir ze testen ob DARS-AS1 d'Zellproliferatioun duerch PACT reguléiert, hu mir SW620 Zellen generéiert déi PACT, DARS-AS1 oder béid iwwerausdrécken.Overexpression vu PACT huet bedeitend Hemmung vun der Zellverbreedung gewisen (Dorënner 3i).Iwwerdeems DARS-AS1 overexpression pro se bedeitend Zell Prolifératioun gefördert, et war kee groussen Ënnerscheed am Wuesstem Taux vun Zellen overexpressing DARS-AS1 a PACT.Dës Resultater suggeréieren datt PACT d'erhéite Prolifératioun entgéintwierke kann duerch DARS-AS1 Iwwerexpressioun verursaacht.
Zënter verschiddene Regioune vun DARS-AS1 verschidde PACT-bindende Fäegkeeten hunn, ënnersicht mir hire relativen Afloss op Zellverbreedung duerch verschidden Iwwerexpressioun vun DARS-AS1 Fragmenter.Am Verglach mat den aneren zwee Fragmenter war DARS-AS1 um 3 'Enn (384-768 nt), den Haapt PACT-Zesummenhang Regioun an DARS-AS1, déi héchste Fäegkeet hat fir d'Zellverbreedung ze stimuléieren (Figebam. 3j).Dës Resultater weisen eng positiv Korrelatioun tëscht der Bindungskapazitéit an der biologescher Funktioun vun DARS-AS1 un.
PACT gouf gemellt als pro-apoptotesch Protein19.Dofir, ënnersicht mir den Effet vun DARS-AS1 op apoptosis.Wéi erwaart, huet DARS-AS1 knockdown däitlech PARP Spaltung an SW620 Zellen erhéicht an den Undeel vun Annexin V-positiven Zellen an SW620, HCT116, HepG2, an MBA-MD-231 Zelllinnen erhéicht (Fig. 3k).3).3f-h), wat beweist datt den anti-apoptoteschen Effekt vun DARS-AS1 a Kriibszellen géint d'apoptose-induzéiert Funktioun vu PACT ass.Zesummegefaasst suggeréieren dës Resultater datt de Mechanismus vun der DARS-AS1 onkogene Funktioun duerch Inhibitioun vun der PACT Funktioun ka sinn.
Als nächst hu mir d'funktionell Implikatioune vun der DARS-AS1-PACT Associatioun exploréiert.PACT gouf gemellt fir PKR duerch direkt Interaktioun z'aktivéieren, wat duerno d'eIF2α Phosphorylatioun verbessert, wat Iwwersetzungsläschung an Apoptose17 verursaacht.Als éischt hu mir iwwerpréift ob DARS-AS1 d'zellulär Lokaliséierung vu PACT a PKR beaflosst.Konfokal Fluoreszenzmikroskopie huet gewisen datt PACT an PKR an SW620 Zellen héich kolokaliséiert goufen mat engem duerchschnëttleche Pearson Korrelatiounskoeffizient vun 0,72.Mëttlerweil huet DARS-AS1 Iwwerexpressioun wesentlech reduzéiert PACT a PKR Co-Lokaliséierung (mengen Pearson Korrelatiounskoeffizient 0.61) (Dorënner 4a).Fir z'ënnersichen ob DARS-AS1 d'PACT-PKR Interaktioun moduléiere konnt, hu mir e Co-Immunoprecipitatioun (Co-IP) Assay mat Anti-PACT Antikörper an SW620 Zelllysate gemaach.PKR war héich an Anti-PACT an Kontroll Zellen beräichert, iwwerdeems PKR Erhuelung bedeitend reduzéiert gouf an lysates aus Zellen overexpressing DARS-AS1 (Figebam. 4b).Purified markéiert PACT an PKR sech fir kënschtlech Protein bindend Assays benotzt.Deementspriechend hunn déi, déi DARS-AS1 geliwwert hunn awer keng Kontroll-RNA, ënnerdréckt PACT-PKR Interaktioun (Dorënner 4c).All Resultater weisen datt DARS-AS1 PACT a PKR Kommunikatioun gestéiert huet.
eng Co-Lokaliséierung vu PACT a PKR a Kontrollzellen oder Zellen, déi DARS-AS1 iwwerausdrécken, gouf mat konfokaler Fluoreszenzmikroskopie observéiert.D'Käre goufen mat DAPI gefierft.Statistesch Resultater goufen aus 16 Fotoen kritt.b Co-Immunoprecipitatioun (Co-IP) mat Anti-PACT Antikörper an Zelllysate vu Kontroll SW620 Zellen oder Zellen déi DARS-AS1 iwwerausdrécken.c Label PACT, gereinegt PKR a kënschtlech transkripéiert mat DARS-AS1 oder Spott-RNA goufen fir kënschtlech Proteinbindungsanalyse inkubéiert.Anti-Fändel Antikörper goufen fir Immunoprecipitatioun benotzt.d Immunoblots mat der uginn antibodies sech an SW620 an HCT116 Zellen transfected mat Kontroll shRNA oder DARS-AS1-shRNA gefollegt vun serum Honger gesuergt.e DARS-AS1 Ausdrock Niveauen geännert Zellempfindlechkeet fir Thapsigargin.SW620 Zellen sech mat DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 overexpression plasmid oder Kontroll plasmid transfected.Zellen sech mat thapsigargin fir 48 Stonnen behandelt an Zell Liewensstandard war mat der MTS reagent bestëmmt.f In vitro transkribéiert DARS-AS1 oder Dummy RNA a gereinegt PACT goufen fir In vitro Aktivéierungsassay an Immunoblot Detektioun benotzt.g Immunoblots, déi dës Antikörper benotzen, goufen op SW620-ctrl Zellen (lénks) oder Zellen, déi PKR Mutanten (riets) overexpresséieren, gemaach.Dës Zellen goufen dann mat Kontroll shRNA oder DARS-AS1-shRNA transfected vun serum Honger.h Flowzytometry huet gewisen datt d'Inaktivéierung vum mutant PKR fir DARS-AS1-induzéiert Apoptose an SW620 Zellen kompenséiert huet.ech Immunoblots mat der uginn antibodies sech an SW620 (lénks) oder HCT116 (riets) Zellen gesuergt.Zellen transfected mat Kontroll shRNA oder DARS-AS1 shRNA sinn serum-entschlof an ergänzt mat 100 nM PKR C16 inhibitor oder DMSO.Skala Bar = 5 µm.Donnéeën gewisen sinn der Moyenne ± Standard deviation vun dräi Experimenter.* p ≤ 0,05 zwee-tailed Student d'T-Test.
Et gëtt allgemeng ugeholl datt eemol PACT mat PKR17 interagéiert, PKR Phosphorylatioun bei Thr451 kann induzéiert ginn.Eis Resultater uginn datt den Niveau vun der PKR Phosphorylatioun wesentlech an DARS-AS1 Knockdown Zellen no Serum Honger (Lalumi 4d an Zousaz Lalumi 4a) erhéicht gouf.Deementspriechend hu mir fonnt datt d'Phosphorylatioun vun eIF2α, den Haapt PKR-Substrat, och wesentlech vun DARS-AS1 shRNA erhéicht gouf (Lalumi 4d an Zousaz Lalumi 4a).Thapsigargin ass en ER Stressor, deen den ER verursaacht fir Ca2+ ze befreien.D'Behandlung mat Thapsigargin gouf gemellt fir den Ausdrock an d'Aktivatioun vu PACT ze induzéieren, wat weider interagéiert mat PKR an aktivéiert, wat zu Apoptose féiert duerch d'Erhéijung vun der eIF2α Phosphorylatioun 18,61.Hei hu mir Thapsigargin als Stimulator vum PACT / PKR Wee benotzt fir z'ënnersichen ob DARS-AS1 Zellen hëllefe kann Stress ze iwwerwannen andeems de PACT / PKR Wee hemmt.Mir observéiert datt den Niveau vun DARS-AS1 Ausdrock positiv mat Zell Resistenz zu thapsigargin soll.SW620 Zellen overexpressing DARS-AS1 besser iwwerlieft wann se mat thapsigargin behandelt ginn, während Zellen mat DARS-AS1 knockdown méi ufälleg ginn (Figebam. 4e).Konsequent mat dëse Resultater, reduzéiert DARS-AS1 Iwwerexpressioun thapsigargin-induzéiert PKR Phosphorylatioun (Ergänzlech Fig. 4b).Am Géigesaz, no thapsigargin Behandlung, PKR an eIF2α goufen zu engem méi héije Mooss an DARS-AS1 knockdown Zellen am Verglach zu Kontroll Zellen phosphorylated (Ergänzlech Lalumi 4b).Interessanterweis huet Thapsigargin den DARS-AS1 Ausdrock an enger dosisofhängeger Manéier induzéiert, wat eng Anti-Stressfunktioun vun DARS-AS1 (Ergänzlech Fig. 4c) uginn kann.Zousätzlech hu mir in vitro Aktivéierungsassays gemaach fir dës Observatiounen ze bestätegen.Kuerz gesot, war PKR aus Zell lysates mat engem Anti-PKR Antikörper gereinegt, dann inkubéiert mat rekombinant PACT an DARS-AS1 in vitro transkribéiert.No der enzymatescher Reaktioun gouf Phospho-PKR mat WB festgestallt.Eis Resultater uginn datt PKR Phosphorylatioun wesentlech vun DARS-AS1 inhibited war, awer net duerch Kontroll RNS (Dorënner 4f).Dës in vitro an in vivo Resultater suggeréieren datt DARS-AS1 PACT-mediéiert PKR Aktivatioun hemmt.Zur selwechter Zäit hu mir och eng Ofsenkung vun der PACT Erhuelung an der Präsenz vun DARS-AS1 observéiert (Figure 4f).Dëst Resultat ass konsequent mat de Resultater vun der in vitro Protein bindend Assay (Dorënner 4c) an illustréiert erëm d'Blockéierungsfunktioun vun DARS-AS1 fir PACT-PKR Associatioun.
Ser246 a Ser287 am D3 Domain vu PACT si fir PKR Aktivatioun ënner celluläre Stress erfuerderlech.Ersatz vun zwee Serinreschter fir Alanin huet mutant PACT (mutD) ginn, wat PKR an der Verontreiung vu Stress aktivéiert huet, an d'Ersatz fir Alanin (mutA) huet de Protokoll ëmgedréit.Well mir d'Wichtegkeet vun dësem Domain an direkter Associatioun mat DARS-AS1 bewisen hunn, hu mir dës zwee PACT Mutanten generéiert fir ze testen ob dës Reschter och an der Interaktioun mat DARS-AS1 involvéiert sinn.Interessanterweis hu béid Mutanten d'Fäegkeet verluer fir DARS-AS1 ze binden (Ergänzlech Fig. 4d), wat suggeréiert datt d'komplett Struktur vum PACT-Protein fir effizient Interaktioun mat DARS-AS1 néideg ass.
Ausserdeem, proposéiere eis Resultater och datt DARS-AS1-shRNA-induzéiert Hemmung vun der Zellproliferatioun deelweis restauréiert ka ginn andeems en dominante negativen PACT-Mutant (PACTmutA) oder e dominante negativen PKR-Mutant (PKRmut) (Ergänzlech Fig. 4e. e) iwwerausdréckt.Overexpression vun dominant-negativen PKR Mutanten reduzéiert PKR Phosphorylatioun induzéiert duerch DARS-AS1 Knockdown souwéi eIF2α Phosphorylatioun an serum entzunnen Zellen (Fig. 4g).Méi wichteg, den Undeel vun apoptotic Zellen vun DARS-AS1 knockdown entschlof war och an Zellen overexpressing PKRmut reduzéiert (Figebam. 4h an Zousaz Lalumi 4g).D'Inhibitioun vun der PKR-Kinaseaktivitéit beaflosst och d'DARS-AS1-Funktioun, well d'Resultater weisen datt d'DARS-AS1-Knockdown selten PKR- an eIF2α-Phosphorylatioun ausgeléist huet wann Zellen mat engem PKR-spezifesche C16-Inhibitor behandelt goufen (Fig. 4i an Ergänzungs Fig. 4h).).Zesummegefaasst suggeréieren eis Resultater datt DARS-AS1 d'Zellproliferatioun fördert, op d'mannst deelweis, andeems d'PACT-mediéiert PKR Aktivatioun hemmt.
Fir d'Roll vun DARS-AS1 an tumorigenesis weider Entdeckung, mir standing zu VIVO Experimenter mat enger Maus xenograft Modell. D'Resultater weisen datt d'Knockdown vun DARS-AS1 dramatesch entholl Wuesstum bei Mais reduzéiert (p Wäert <0.0001) (Figebam. 5a). D'Resultater weisen datt d'Knockdown vun DARS-AS1 dramatesch entholl Wuesstum bei Mais reduzéiert (p Wäert <0.0001) (Figebam. 5a). D'Responsabilitéit vum DARS-AS1 ass méiglecherweis méiglecherweis op <0,0001) (5 Joer). D'Resultater weisen datt DARS-AS1 Knockdown drastesch den Tumorwachstum bei Mais reduzéiert (p Wäert <0.0001) (Dorënner 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（囀5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a） D'Responsabilitéit vum DARS-AS1 ass e bësse méi wéi 0,0001 bis 5 Prozent. D'Resultater weisen datt DARS-AS1 Knockdown wesentlech reduzéiert Tumorwachstum bei Mais (p Wäert <0.0001) (Dorënner 5a).Also, an der DARS-AS1 knockdown Grupp, war et eng bedeitend Ofsenkung vun mengen entholl Volume vun ongeféier 72,9% an heescht entholl Mass vun ongeféier 87,8% (Dorënner 5b-d).Dës Resultater proposéiere staark datt DARS-AS1 däitlech entholl Wuesstem zu VIVO förderen kann.
Effekter vun ad DARS-AS1 Knockdown op kolorektal Onkogenese bei nackte Mais.Wuesstem Kéiren (a), entholl Gréisst (b), Gewiicht (c), an entholl Biller (d) sinn gewisen.Feeler Baren representéieren ± SEM. n = 10. ****p < 0,0001, duerch zwee-tailed Student t Test. n = 10. ****p < 0,0001, duerch zwee-tailed Student t Test. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 zwee-tailed Student d'T-Test.n = 10. ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 op двусторонему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 zwee-tailed Student's T-Test.e Kaplan-Meier analyséiert d'Korrelatioun tëscht DARS-AS1 Ausdrock Niveauen an allgemeng Iwwerliewe bei Patienten mat UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, an LGG.Héich Niveauen vum DARS-AS1 Ausdrock bei Patienten waren an den Top 50%;den nidderegen Niveau vum DARS-AS1 Ausdrock bei Patienten war am ënneschten 50%.p-Wäerter goufen mam Log Rank Test bestëmmt.f Proposéiert Modell an deem DARS-AS1 de PACT-PKR Passerelle an entholl Wuesstem reguléiert.
Fir de klineschen Impakt vun DARS-AS1 besser ze verstoen, hu mir d'Korrelatioun tëscht sengem Ausdrock an dem Patient Iwwerliewe iwwerpréift.Duerch d'Analyse vun der TCGA Dataset, hu mir erausfonnt datt méi héije DARS-AS1 Ausdrock mat uveal Melanom (UVM), Nierenchromophobie (KICH), Nierenpapillärzellkarzinom (KIRP), Mesotheliom (MESO), Multiplex assoziéiert ass.Ënneschten Iwwerliewe war vill mat glioblastoma morphosis (GBM) a Patienten mat niddereg-Schouljoer Gehir glioma (LGG) assoziéiert (Dorënner 5e).Dës Resultater hindeit datt DARS-AS1 eng wichteg Roll am klineschen entholl Werdegang spille kann a vläicht e potentielle predictive Biomarker an MÉI Cancers ginn.
An dëser Etude, mat grousser Skala CRISPRI funktionell Duerchmusterung, hu mir festgestallt datt DARS-AS1 lncRNA Kriibszellstress iwwerwannt andeems zwee Schlësselstressresponderen reguléieren, PACT a PKR.Andeems Dir direkt mat PACT interagéiert, huet DARS-AS1 PACT-mediéiert PKR Aktivatioun inhibitéiert, doduerch den apoptoteschen Zell Doud verhënnert an d'Zellproliferatioun fördert (Fig. 5f).Upregulatioun vun DARS-AS1 gouf a verschiddenen Aarte vu Kriibs observéiert, suggeréiert datt seng Funktioun fir d'Iwwerliewe vu Kriibszellen ënner stresseg Konditiounen ze förderen, fir verschidde Kriibsarten breet applicabel ka sinn.
PACT gouf als PKR Aktivatorprotein identifizéiert, a PACT-mediéiert PKR Aktivatioun spillt eng wichteg Roll bei Stressreaktiounen andeems se Transkriptioun, Iwwersetzung, Apoptose an aner wichteg cellulär Prozesser reguléieren62.Fir Joerzéngte goufen Versich gemaach fir d'Kriibsspezifesch Regulatioun vun der PACT-PKR Kaskade ze verstoen.Hei huet eis Studie en anere Mechanismus vu Reguléierung vu PACT-PKR a Kriibszellen duerch cellulär lncRNA DARS-AS1 opgedeckt, déi direkt un PACT bindt, PACT-PKR Interaktioun blockéiert, PKR Aktivatioun an eIF2α Phosphorylatioun hemmt, doduerch Stress-induzéiert Apoptose hemmt an Stimulatioun vun eventuell Kriibsproliferatioun.Zellen.Dës Entdeckung werft Liicht op potenziell lncRNA Ziler fir Kriibsprognose an Therapie.
Eis Donnéeën hunn gewisen datt DARS-AS1 Knockdown Zellen op Serumhonger sensibiliséiert mat enger wesentlecher Erhéijung vu phosphoryléierter PKR an eIF2α.Dës Resultater hindeit datt DARS-AS1 Kriibszell Iwwerliewe ënner schwieregen Konditiounen fördert andeems d'PACT /PKR Aktivitéit hemmt.Verschidde aner net-kodéierend RNAs, wéi ASPACT an nc886, sinn och an der PACT / PKR Achs involvéiert andeems se PACT48 mRNA downreguléieren oder d'Autophosphorylatioun reguléieren andeems se un PKR49,50,64 binden.Ënnert hinnen handelt DARS-AS1 als Disruptor vun der PACT-PKR Associatioun.Dës Etude beräichert eist Verständnis vun der PACT / PKR Achs Reguléierung an d'Roll vun lncRNAs bei Stressreaktiounen.
PACT enthält dräi separat Domainen.Jiddwer vun den éischten zwee dsRBDs ass genuch fir eng héich Affinitéitsbindung vu PACT op PKR z'erreechen, während dat drëtt Domain (D3) fir PKR Aktivatioun in vitro an in vivo erfuerderlech ass.Eis Etude huet gewisen, datt DARS-AS1 preferentially mat der D3 Domain interagéiert (Lalumi 3h).Mat der grousser Gréisst vun der lncRNA (768 Nukleotiden), kann DARS-AS1 Bindung un D3 d'Interaktioun tëscht dem PACT Domain vun dsRBD a PKR kierperlech hemmen, an doduerch d'Associatioun vu PACT a PKR blockéieren.PACT Punkt Mutatiounen déi Ser246 a Ser287 am D3 ersat hunn duerch Alanin oder Aspartat hunn seng bindend Affinitéit fir DARS-AS1 gestéiert, wat op d'Wichtegkeet vun den D3's allgemenge strukturellen an elektresche Properties an hirer Associatioun weist.Weider Detailer vun dësem Mechanismus wäert an Zukunft néideg ginn, mat méi präzis biochemical Analyse an héich Opléisung PACT strukturell Analyse.
Virdrun Studien hu gemellt datt DARS-AS1 Zell Prolifératioun duerch verschidde Mechanismen fördert51,52,53.An engem Beispill hunn d'Enquêteuren observéiert datt DARS-AS1 säin antisense Protein-kodéierend DARS Gen upreguléiert huet andeems se miP-194-5p an Nierkriibszellen zielen.Wéi och ëmmer, an der heiteger Studie huet DARS-AS1 Knockdown wéineg Effekt op DARS Transkriptioun a verschidde Kriibsarten, dorënner op d'mannst kolorektal, Broscht a Liewerkriibs.Well lncRNAs weise Zell- an Otemschwieregkeeten-spezifesch Ausdrock Musteren, funktionell Mechanismen kënnen net iwwer Kriibs Zorte conserved ginn, déi zu dëser Diskrepanz tëscht eisen Observatiounen a virdrun Bewäertungen vun verschidden Cancers bäidroen kann.Besonnesch Studien sinn néideg fir déi spezifesch Mechanismen vu verschiddene physiologeschen a pathologesche Prozesser ze klären.
Eng Analyse vu klineschen Donnéeën huet gewisen datt DARS-AS1 Ausdrock an Tumoren ëmgedréint mat der Iwwerliewe vu Kriibspatienten korreléiert ass, wat d'Wichtegkeet vun der DARS-AS1 /PACT /PKR Achs an der Kriibsprognose ënnersträicht.Als Conclusioun weist eis Studie datt DARS-AS1 e Reguléierer vun der PACT / PKR Signalachs ass, d'Prolifératioun vu Kriibszellen fördert an d'Apoptose während der Stressreaktioun hemmt, wat eng aner Fuerschungslinn ubitt an interessant ass fir zukünfteg Fuerschung iwwer potenziell Behandlungen. .
Mënsch Zell Linnen SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 an HEK293T sech aus der National Zell Linn Ressource Infrastruktur an China kritt.All Zellen goufen am DMEM mëttelfristeg (DMEM, Thermo Fisher Wëssenschaftlech, Waltham, MA) erhale mat 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) an 1% Penicillin-Streptomycin (Thermo Fisher Wëssenschaftlech) bei 37 ° C, 5% CO2.inkubator.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti-Fändel, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (Phosphor S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (Phosphor S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulin, CST (2128);normal Maus IgG, CST (5415S);normal Kanéngchen IgG, CST (2729S).Antikörper goufen 1:1000 an PBST fir Western blotting an 1:100 fir IP verdünnt.
sgRNAs goufen entwéckelt mat engem ëffentlech verfügbaren Tool mam Numm CRISPR-ERA66.Mir hunn d'Default Outil Parameteren fir sgRNA Entwécklung an den Algorithmus berechnen sgRNA bindend Siten an der 3 kb Regioun benotzt.zentréiert op TSS.Poole vun sgRNA oligonucleotides sech um CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) synthetiséiert an an humanized pgRNA plasmids gekloon (Addgene #44248).Am Ganzen 12 µg vun zesummegefaasst humaniséierter pgRNA Plasmid, 7.2 µg vun psPAX2 (Addgene #12260), a 4.8 µg vun pMD2.G (Addgene #12259) goufen co-transfected an 5 x 106 HEK293T HEK293T Transection Platen benotzt DNA 10 Zellen (CWBIO, Peking, China) no den Instruktioune vum Hiersteller.Virus-enthale Supernatanten goufen 48 an 72 Stonnen no der Transfektioun gesammelt an duerch en 0,45 µm Filter gefiltert.Fir Duerchmusterung, SW620 Zellen ausdrécken dCas9 /KRAB Fusioun Protein sech duerch Virus transduction kritt.Geännert SW620 Zellen sech mat der Virus Bibliothéik zu véier onofhängeg Wonn Experimenter op engem MOI vun 0,1-0,3 infizéiert a sech mat 2 μg /ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) fir 2 Deeg Echantillon.Duerno goufen d'Zellen fir 18 Deeg in vitro kultivéiert mat engem Minimum Bibliothéik Ofdeckung vun 500 Zellen /sgRNA fir Duerchmusterung.
Genomesch DNA gouf no den Instruktioune vum QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Däitschland; 51183) extrahéiert.Am Ganzen goufen 100 μg genomesch DNA pro biologescher Widderhuelung benotzt fir d'Bibliothéik ze bauen.D'sgRNA Regioun gouf duerch zwou Ronne vu PCR verstäerkt a verbonne mat engem Barcode.
PCR Produkter goufe gereinegt mat NucleoSpin® Gel a PCR Reinigungskit (MACHEREY-NAGEL, Düren, Däitschland; 740609.250) a quantifizéiert mat Qubit™ HS duebelstrengend DNA Detektiounskit (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
D'MTS assay war benotzt Zell Prolifératioun ze moossen.Zellen goufen an 96-gutt Placke bei enger initialer Dicht vun 2000 Zellen /Well gesaat.D'relativ Zuel vun Zellen war all Dag op der uginn Zäit fir am Ganzen 4-6 Deeg gemooss.Fir all gutt, 20 μl MTS reagent (Promega) war mat 100 μl vun DMEM verdënntem, incubated mat Zellen fir 4 h bei 37 ° C, an dann OD490 gemooss.
D'Kapazitéit fir onverankerte Wuesstum gouf entdeckt duerch d'Analyse vun der Bildung vu Kugelen.Kuerz, 2000 Zellen transfected mat shRNA DARS-AS1 oder Kontroll shRNA goufen an ultra niddereg Uschloss microplates (Corning) mat mëttelfristeg änneren all 4 Deeg cultured.D'Sphäroide goufen no 14 Deeg gezielt.500 Zellen transfected mat der DARS-AS1 overexpression plasmid oder engem Kontroll plasmid sech fir d'Erhéijung assay benotzt, soss war d'Method onverännert.
RNS gouf mat T7 RNS Polymerase a Biotin-16-UTP (Roche 1138908910) transkriptéiert no den Instruktioune vu Riboprobe® Kombinatiounssystemer (Promega P1440).D'Primer déi hei benotzt ginn sinn an der Ergänzungstabell 4 opgelëscht.
Protein-coding PACT oder PKR Regioune goufen an pET15b (Addgene #73619) gekloont an an BL21 (DE3) transforméiert.D'Bakterien goufen iwwer Nuecht an LB mat ampicillin geliwwert incubated an dann 100-fach mat frësch LB verdënntem.Wann d'OD600 vun der mëttelfristeg erreecht 0,8, 1 mM IPTG war dobäi Protein Ausdrock ze induce.No der Inkubatioun iwwer Nuecht mat sanfte Rüschen (250 RPM- bei 20 ° C), gouf d'Zellpellet duerch Zentrifugéierung (4000 RPM-, 10 min, 4 ° C) gesammelt.Resuspendéiert d'Zellpellet am Lysis-Puffer (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) an inkubéiert op Äis fir 30 min, sonicéiert dann (15 min, 5 s on / off, op Äis) an centrifugéiert (13.000) U/min).30 min, 4°C).De Supernatant gouf duerno op Ni-NTA Harz (QIAGEN) 3 Mol bei 4 ° C gelueden, 4 Mol mat Wäschbuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM Imidazol, 250 mM NaCl) gewäsch an 3 Mol eluéiert, mat engem Total vun 10 ml eluent Puffer (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazole).Purifizéiert Protein gouf mat WB bestëmmt an d'Konzentratioun gouf mam Qubit ™ Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific; Q 33212) bestëmmt.
RIP Assays goufen duerchgefouert wéi virdru beschriwwen, mat Ännerungen.Kuerz gesot, 1x RIP-Puffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, RNasin Ribonuklease-Inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnologie), 1 mM DDM, Protease) lyséiert zytostatesch 1 x 107 Cocktail (Roche, 1 mM DTT) an centrifuge bei 13.000 rpm fir 15 min bei 4 ° C.De Supernatant gouf duerno mat Protein A + G magnetesche Perlen (Millipore) inkubéiert, konjugéiert mat 5 μg Anti-PACT Antikörper (Abeam) oder IgG (CST).D'Pärelen goufen 5 Mol mat 5x RIP Puffer gewäsch, duerno mat Proteinase K (NEB) verdaut.RNS war mat Trizol ofgebaut an duerch RT-qPCR bestëmmt.Primer ginn an der Ergänzungstabell 5 presentéiert.
Den in vitro RIP Assay gouf no engem modifizéierten Standard RIP Assay Protokoll gemaach.Insgesamt 5 pmol vun in vitro transkribéierten RNA gouf 1x mat RIP-Puffer verdünnt an duerch Inkubatioun bei 65 ° C fir 5 Minutten annealéiert, gefollegt vu luesen Ofkillen op Raumtemperatur.Am Ganzen 5 pmol vun intakt oder mutéiert Fändel-Label PACT Proteinen sech aus E. coli gereinegt.Inkubéiert mat renaturéierten RNA fir 2 Stonnen bei 4 ° C a befollegt déi uewe Prozedur fir RIP Analyse fir Anti-Fändel IP.
Fir RNS Extensioun Analyse, goufen 1 × 107 Zellen mat 1xRIP Prellbock lysed.No der Zentrifusioun bei 13.000 RPM- fir 15 min bei 4 ° C, gouf de Supernatant mat 30 μl Streptavidin magnetesche Perlen (Beckman) fir 2 h bei 4 ° C virbehandelt.De gereinegt Lysat gouf duerno mat Hef tRNA geliwwert a mat 40 pmol vun renaturéierten RNA iwwer Nuecht bei 4 ° C inkubéiert, duerno fir eng aner 2 Stonnen an 20 μl vun neie streptavidin magnetesche Perlen, déi mat BSA blockéiert goufen, bäigefüügt.D'Wäschstuf besteet aus 4 Mol mat 5x RIP-Puffer a 4 Mol mat 1x RIP-Puffer.Déi entspriechend Proteinen sech mat Biotin elution Prellbock (25 mm Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mm D-biotin, PMSF) elued an op NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) getrennt.No Sëlwerfaarf (Beyotime Biotechnologie) goufen verschidde Bands ausgeschnidden an duerch MS analyséiert.
Co-IP Analyse gouf gemaach fir d'Interaktioun tëscht PACT a PKR ze testen.Kuerz gesot, supernatant Lysate goufen duerch incubating 1 x 107 lysed Zellen an 1 x RIP Prellbock virbereet gefollegt vun centrifugation bei 13.000 RPM- fir 15 Minutten bei 4 ° C.Lysate goufen mat Protein A + G magnetesche Perlen gelueden, konjugéiert mat 5 µg Anti-PACT Antikörper, a sanft iwwer Nuecht bei 4 ° C rotéiert.D'Kärelen goufen 3 Mol mat 5 × RIP Puffer gewäsch, zweemol mat 1 × RIP Puffer a mat 1 × SDS Puffer eluéiert.D'erholl Protein war vun SDS-PAGE gelies analyséiert a vun WB entdeckt.
Zwee pmol vun flagged PACT an 1 pmol vun PKR sech aus E. coli gereinegt.Verdünnt an 1 × RIP-Puffer a inkubéiert mat 10 pmol renaturéiert RNA fir 2 Stonnen bei 4 ° C.Duerno goufen se mat Protein A + G magnetesche Bead-konjugéierten Anti-Label Antikörper fir eng zousätzlech zwou Stonnen inkubéiert.D'Kärelen goufen duerno véier Mol mat 1x RIP-Puffer gewäsch a mat 1x SDS-Puffer eluéiert.Déi doraus resultéierend PACT an PKR goufen duerch WB entdeckt.