Merci fir besicht Nature.com.D'Browser Versioun déi Dir benotzt huet limitéiert CSS Ënnerstëtzung.Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech en aktualiséierte Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten).An der Tëschenzäit, fir weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, wäerte mir de Site ouni Stiler a JavaScript maachen.
Enzymatesch Proximitéit Etikettéierungsmethoden baséiert op aktivéierten Ester oder Phenoxy Radikale gi wäit benotzt fir subzellulär Proteome a Proteininteraktoren a liewegen Zellen ze kartéieren.Wéi och ëmmer, aktivéiert Ester si manner reaktiv, wat zu engem breede Labelradius resultéiert, a Phenoxyradikale generéiert duerch Peroxidbehandlung kënne Redoxweeër stéieren.Hei bericht mir eng Proximitéit Etikettéierung ofhängeg Photoaktivéierung (PDPL) Method entwéckelt andeems d'miniSOG Photosensibilisator Protein genetesch mat engem Protein vun Interesse verbënnt.Ausgeléist vu bloe Liicht a kontrolléiert duerch Beliichtungszäit, gëtt Singlet Sauerstoff generéiert an dann spatiotemporally geléist Etikettéierung vun Histidinreschter duerch d'Anilinsonde gëtt erreecht.Mir weisen seng héich Vertrauen duerch organellespezifesch Proteomemapping.E Side-by-Side Verglach vu PDPL mat TurboID weist eng méi spezifesch an ëmfaassend proteomesch Ofdeckung vu PDPL.Als nächst hu mir PDPL op de Krankheet-assoziéierten Transkriptiouns Koaktivator BRD4 an E3 Parkin Ligase applizéiert a virdru onbekannt Interaktoren fonnt.Duerch Iwwerexpressiounsscreening goufen zwee onbekannte Substrate, Ssu72 an SNW1, fir Parkin identifizéiert, deem seng Degradatioun duerch den Ubiquitinatioun-Proteasom-Wee vermëttelt gëtt.
Genau Charakteriséierung vu Proteinnetzwierker ënnersträicht vill fundamental cellulär Prozesser.Dofir wäert eng héich präzis spatiotemporal Kartéierung vu Proteininteraktiounen eng molekulare Basis ubidden fir biologesch Weeër, Krankheet Pathologie z'entschlësselen an dës Interaktioune fir therapeutesch Zwecker ze stéieren.Zu dësem Zweck sinn Methoden déi fäeg sinn temporär Interaktiounen a liewegen Zellen oder Stoffer z'entdecken héich wënschenswäert.Affinitéit Purification Mass Spectrometry (AP-MS) gouf historesch benotzt fir bindend Partner vu Proteinen vun Interesse (POIs) ze identifizéieren.Mat der Entwécklung vu quantitative Proteomics Methoden gouf Bioplex3.0 erstallt, déi gréisste Datebank vu Proteinnetzwierker baséiert op AP-MS.Och wann AP-MS ganz mächteg ass, sinn d'Zelllysis- a Verdünnungsschrëtt am Workflow biaséiert op schwaach an transient bindend Interaktiounen a stellen Post-Lys-Artefakte wéi spurious Interaktiounsparen, déi d'Kompartimentaliséierung virum Lysis feelen.
Fir dës Themen unzegoen, sinn onnatierlech Aminosäuren (UAA) mat crosslinking Gruppen an enzymatesch Emgéigend Label (PL) Plattformen (zB APEX a BioID)5 entwéckelt.Och wann d'UAA Method erfollegräich a ville Szenarien applizéiert gouf an Informatioun iwwer direkt Proteinklebstoff ubitt, ass d'Optimisatioun vun der UAA Insertion Site nach ëmmer erfuerderlech.Méi wichteg ass et eng stoichiometresch Etikettéierungsmethod déi e katalytesche Réckgang vu Labelevenementer feelt.Am Géigesaz, enzymatesch PL Methoden, wéi d'BioID Method, fusionéieren déi manipuléiert Biotinligase zu POI7, wat duerno Biotin aktivéiert fir e reaktive Biotinyl-AMP Ester Zwëschenprodukt ze bilden.Den Enzym katalyséiert also eng aktivéiert Biotin "Wollek", déi proximal Lysinreschter markéiert.Wéi och ëmmer, BioID erfuerdert méi wéi 12 Stonnen fir e genuch markéiert Signal ze kréien, wat seng Benotzung mat temporärer Resolutioun ausschléisst.Mat Hëllef vun der geriichtter Evolutioun baséiert op Hef Display, gouf TurboID baséiert op BioID entwéckelt fir méi effizient ze sinn, wat effizient Etikettéierung mam Biotin bannent 10 Minutten erlaabt, wat méi dynamesch Prozesser erlaabt ze studéieren.Well TurboID héich aktiv ass an endogene Biotinniveauen duer fir Low-Level Etikettéieren, gëtt Background Etikettéierung e potenzielle Problem wann héich verstäerkt an timed Etikettéierung erfuerderlech ass duerch d'Zousatz vun exogenen Biotin.Zousätzlech sinn aktivéiert Ester schlecht reaktiv (t1 / 2 ~ 5 min), wat zu engem groussen Etikettéierungsradius féiere kann, besonnesch no Sättigung vun Nopeschproteine mat Biotin 5. An enger anerer Approche, genetesch Fusioun vun manipuléierten Ascorbatperoxidase (dh Biotin- phenol radikaler an erlaabt Protein Etikettéierung bannent enger Minutt 9, 10. APEX ass wäit benotzt subcellular proteomes, Membran Protein komplex z'identifizéieren, an zytosolic Signal Protein komplex 11, 12. Wéi och ëmmer, de Besoin fir héich Konzentratioune vun Peroxides kann Redox Proteinen oder Weeër Afloss, stéieren cellulär Prozesser.
Also, eng nei Method déi fäeg ass méi reaktiv markéiert Radius Ënnerdréckungsarten mat héijer raimlecher an zäitlecher Genauegkeet ze generéieren ouni wesentlech cellulär Weeër ze stéieren ass e wichtegen Zousaz zu existente Methoden. Ënnert de reaktiven Spezies huet Singlet Sauerstoff eis Opmierksamkeet wéinst senger kuerzer Liewensdauer a limitéierter Diffusiounsradius (t1/2 <0.6 µs an Zellen)13. Ënnert de reaktiven Spezies huet Singlet Sauerstoff eis Opmierksamkeet wéinst senger kuerzer Liewensdauer a limitéierter Diffusiounsradius (t1/2 <0.6 µs an Zellen)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Ënnert den aktive Formen huet Singlet Sauerstoff eis Opmierksamkeet ugezunn wéinst senger kuerzer Liewensdauer a limitéierter Diffusiounsradius (t1/2 <0,6 µs an Zellen)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6跳ﺬ伕跳ﺬ伕〷sﺬ 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Ënnert aktive Formen zitt Singlet Sauerstoff eis Opmierksamkeet wéinst senger kuerzer Liewensdauer a limitéierter Diffusiounsradius (t1/2 <0,6 μs an Zellen).Singlet Sauerstoff gouf gemellt fir zoufälleg Methionin, Tyrosin, Histidin an Tryptophan ze oxidéieren, sou datt et polar 14,15 fir Uschloss un Amin oder Thiol baséiert Sonden mécht16,17.Och wann Singlet Sauerstoff benotzt gouf fir subcellulär Kompartiment RNA ze bezeechnen, bleiwen Strategien fir endogene POI Proximitéitsmarker ze repurposéieren onerfuerscht.Hei presentéiere mir eng Plattform genannt Photoactivation-dependent Proximity Labeling (PDPL), wou mir blo Luucht benotze fir POIs ze beliichten, déi mat engem MiniSOG Photosensibilisator verschmolzelt sinn an Singlet Sauerstoff Generatioun ausléisen fir proximal Reschter ze oxidéieren, gefollegt vun Aminhaltege Modifikatioune fir chemesch Sonden ze oxidéieren an Mëttelstuf liewen Zellen..Mir hunn eng Grupp vu chemesche Sonden getest fir d'Tagspezifizitéit ze maximéieren an d'Modifikatiounsplazen identifizéiert mat engem oppene Proteomics Workflow.E Side-by-Side Verglach vu PDPL mat TurboID weist eng méi spezifesch an ëmfaassend proteomesch Ofdeckung vu PDPL.Mir hunn dës Approche fir organellespezifesch Markéierer vum subzelluläre Proteom an allgemeng Proteom Identifikatioun vu Bindungspartner fir de Kriibs-assoziéierten epigenetesche Reguléierungsprotein BRD4 an der Parkinson-Krankheet-assoziéierter E3 Ligase Parkin applizéiert, déi souwuel e bekannten an onbekannt Netzwierk vu Protein bestätegt hunn. Interaktiounen..D'Kapazitéit vum PDPL fir E3 Substrate a grousse Proteinkomplexen ze erkennen representéiert eng Situatioun wou d'Unerkennung vun indirekten Bindemëttel erfuerderlech ass.Zwee onbekannt Parkin-Substrate vermëttelt duerch Ubiquitinatioun-Proteasom goufen op der Plaz bestätegt.
Photodynamesch Therapie (PDT)19 a Chromophor-assistéiert Laser Inaktivéierung (CALI)20, an där d'Liichtbestralung mat Photosensibilisatoren Singlet Sauerstoff generéiert, kann Zilproteine inaktivéieren oder Zell Doud verursaachen.Well Singlet Sauerstoff eng héich reaktiv Substanz mat enger theoretescher Diffusiounsdistanz vu ronn 70 nm ass, kann raimlech limitéiert Oxidatioun ronderëm de Photosensibilisator kontrolléiert ginn.Baséierend op dësem Konzept hu mir décidéiert Singlet Sauerstoff ze benotzen fir enk Etikettéierung vu Proteinkomplexe a liewegen Zellen z'erreechen.Mir hunn eng PDPL chemoproteomic Approche entwéckelt véier Funktiounen ze erfëllen: (1) d'Generatioun vun aktiv Singlet Sauerstoff ähnlech zu der PL enzymatic Approche ze katalyséieren;(2) gitt Zäit-geléist Etikettéieren op Liicht Initiatioun;(3) duerch Ännerung (4) Vermeit d'Benotzung vun endogene Kofaktoren (wéi Biotin) fir den Hannergrond ze reduzéieren, oder benotzt héich perturbéierend exogen Reagenz (wéi Peroxide) fir d'Zellbelaaschtung fir Ëmweltstress ze minimiséieren.
Photosensibilisatoren kënnen an zwou Kategorien ënnerdeelt ginn, dorënner kleng molekulare Gewiicht fluorophores (zB rose Bengal, methylene blo)22 an genetesch kodéiert kleng Proteinen (zB MiniSOG, KillerRed)23.Fir e modulare Design z'erreechen, hu mir déi éischt Generatioun PDPL Plattform entwéckelt andeems Photosensibilisator (PS) Proteinen op POI24,25 bäigefüügt ginn (Figur 1a).Wann se mat bloe Luucht bestrahlt ginn, oxidéiert Singlet Sauerstoff proximal nukleophil Aminosäurereschter, wat zu enger umpolung Polaritéit resultéiert déi elektrophil ass a ka weider mat Amin Sonde Nukleophilen reagéieren16,17.D'Sond ass entworf mat engem Alkyne Grëff fir Klickchemie z'erméiglechen an erof ze zéien fir LC / MS / MS Charakteriséierung.
Schematesch Illustratioun vun der Etikettéierung vu Proteinkomplexe vermittelt duerch miniSOG.Wann se u bloe Luucht ausgesat sinn, generéieren Zellen, déi miniSOG-POI ausdrécken, Singlet Sauerstoff, wat interagéiert Proteine ännert awer net net-bindend Proteinen.Zwëschenprodukter vun der Photooxidatioun ginn duerch Relaisetiketten vun der Aminchemescher Sonde ofgefaangen fir kovalent Addukten ze bilden.D'Alkynylgrupp op der Chimiesonde erlaabt Klickchemie fir d'Beräicherung duerch Pull-Down gefollegt vun der LC-MS / MS Quantitatioun.b Chemesch Struktur vun Amin Sonden 1-4.c Representativ fluoreszent Gel Analyse vu mitochondrial lokaliséierter miniSOG-mediéierte proteomesche Markéierer mat Sonde 1-4 a relativer Quantifikatioun baséiert op Gel Densitometrie.D'Signal-ze-Hannergrond Verhältnis vu chemesche Sonden gouf mat negativen Kontrollexperimenter bewäert, ausser blo Luucht oder HEK293T Zellen ouni miniSOG Ausdrock.n = 2 biologesch onofhängeg Echantillon.All Punkt stellt eng biologesch Replik duer.d Vertrieder Detektioun a Quantifikatioun vun PDPL benotzt optimiséiert Sonde 3 an der Präsenz oder Feele vun der uginn PDPL Komponente wéi c.n = 3 biologesch onofhängeg Echantillon.All Punkt stellt eng biologesch Replik duer.Centerlines a Whiskers representéieren d'Moyenne an ± Standarddeviatioun.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Konfokal Imaging vu Singlet Sauerstoff mat wäitroude Si-DMA Fleck.Skala Bar: 10 µm.Gel Imaging a konfokal Experimenter goufen onofhängeg op d'mannst zweemol mat ähnlechen Resultater widderholl.
Mir getest éischt d'Fähegkeet vun der reife photosensibilisatoren miniSOG26 an KillerRed23, stabil ausgedréckt an HEK293T, propargylamine Etikettéierung vun der proteome als chemesch Sonde (Ergänzlech Lalumi 1a) vermëttelen.Gel Fluoreszenz Analyse huet gewisen datt ganz Proteome Etikettéierung mat MiniSOG a bloe Liichtbestralung erreecht gouf, wärend kee sichtbare Etikettéierungsprodukt mat KillerRed observéiert gouf.Fir de Signal-zu-Hannergrond Verhältnis ze verbesseren, hu mir dunn eng Rei vu chemesche Sonden getest, déi Anilin (1 an 3), Propylamin (2) oder Benzylamin (4) enthalen.Mir beobachtet datt HEK293T Zellen selwer e méi héije Background Signal am Verglach zu kee bloe Liicht haten, méiglecherweis wéinst dem endogenen Riboflavin Photosensibilisator, Flavin Mononucleotid (FMN) 27. Anilin-baséiert chemesch Sonden 1 an 3 hunn eng besser Spezifizitéit ginn, mat HEK293T stabil ausdréckend MiniSOG a Mitochondrien, déi eng > 8-fach Erhéijung vum Signal fir Sonde 3 weisen, wärend Sonde 2 benotzt an der RNA-Etikettéierungsmethod CAP-seq nëmmen ~2.5- ausfalen Signal Erhéijung, wahrscheinlech wéinst verschiddene Reaktiounsfäegkeet Virléiften tëscht RNS a Protein (Figebam. 1b, c). Anilin-baséiert chemesch Sonden 1 an 3 hunn eng besser Spezifizitéit ginn, mat HEK293T stabil ausdréckend MiniSOG a Mitochondrien, déi eng > 8-fach Erhéijung vum Signal fir Sonde 3 weisen, wärend Sonde 2 benotzt an der RNA-Etikettéierungsmethod CAP-seq nëmmen ~2.5- ausfalen Signal Erhéijung, wahrscheinlech wéinst verschiddene Reaktiounsfäegkeet Virléiften tëscht RNS a Protein (Figebam. 1b, c).Anilin-baséiert chemesch Sonden 1 an 3 hu besser Spezifizitéit gewisen: HEK293T, déi miniSOG an der Mitochondrien stabil ausdréckt, weist méi wéi eng 8-fach Erhéijung vum Signal fir Sonde 3, während Sonde 2, benotzt an der CAP-seq RNA Etikettmethod, nëmmen weist ~ 2,5-fantastesch Signal Erhéijung, wahrscheinlech wéinst verschiddene Reaktiounsfäegkeet Virléiften tëscht RNS a Protein (Figebam. 1b, c).基于苯胺 苯胺的苯胺的的的的化学 探针 1 和和和具有 具有具有具有具有具有具有具有具有具有特异性特异性, hek2, hek2933TG, 在 稳定 探针 探针 探针 的 探针 探针 探针 的 的 探针 的 稳定 稳定 的 稳定 的 的 稳定 稳定 的 的 的 的 的 稳定 的 的 的 的2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于苯胺 苯胺苯胺 的 化学 探针 1 和 UN 具有具有 具有和 具有 的 的的, hek29333T 81.3T 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 的 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 的 稳定 稳定 稳定 稳定 的 的 的 的 稳定 的 稳定 稳定 稳定 的 的 稳定 稳定 稳定 的 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 的 的 的 稳定 的 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 的 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 的 的 稳定-倍信号增加，可能是由于RNAAnilin-baséiert chemesch Sonden 1 an 3 hu besser Spezifizitéit, HEK293T stabil ausgedréckt MiniSOG an Mitochondrien, an Sonde 3 hat iwwer 8-fach Erhéijung vum Signal, während Sonde 2 fir d'CAP-seq RNA Etikettmethod nëmmen ~ 2,5-fach Erhéijung huet.am Signal, wahrscheinlech wéinst verschiddene Reaktioun Virléiften tëscht RNS a Protein (Fig. 1b, c).Ausserdeem goufen Sonde 3 Isomeren an Hydrazinesonden (Sonden 5, 6, 7) getest, déi d'Optimiséierung vun der Sonde 3 bestätegt (Ergänzlech Fig. 1b, c).Ähnlech, an-gel fluorescence Analyse réischt aner optimiséiert experimentell Parameteren: Bestrahlungswellelängt (460 nm), chemesch Sonde Konzentratioun (1 mm) an Bestrahlung Zäit (20 min) (Ergänzlech Lalumi 2a-c).All Komponent oder Schrëtt am PDPL Protokoll ofginn huet zu bedeitende Signalreverséierung op den Hannergrond gefouert (Fig. 1d).Notamment gouf d'Protein-Etikettéierung wesentlech reduzéiert an der Präsenz vun Natriumazid oder Trolox, déi bekannt sinn fir Singlet Sauerstoff auszeschléissen.D'Präsenz vun D2O, déi bekannt ass fir Singlet Sauerstoff ze stabiliséieren, verbessert d'Etikettéierungssignal.Fir de Bäitrag vun anere reaktive Sauerstoffaarten zu der Etikettéierung z'ënnersichen, goufen Mannitol a Vitamin C bäigefüügt fir Hydroxyl- a Superoxid-radikale Scavengers z'etabléieren, respektiv 18, 29, awer si goufen net fonnt fir d'Etikettéierung ze reduzéieren.Zousätzlech vun H2O2, awer net Beliichtung, huet net zu Etikettéierung (Ergänzlech Fig. 3a) gefouert.Fluoreszenz Singlet Sauerstoff Imaging mat Si-DMA Sonden bestätegt d'Präsenz vu Singlet Sauerstoff am HEK293T-miniSOG Drot, awer net am Original HEK293T Drot.Zousätzlech, mitoSOX Red konnt net superoxide Produktioun no Beliichtung z'entdecken (Figebam. 1e an Zousaz Lalumi 3b) 30. Dës Donnéeën proposéiere staark dass Singlet Sauerstoff den Haaptgrond reaktiv Sauerstoff Arten responsabel fir spéider proteomic Etikett ass.Cytotoxicity vun PDPL war évaluéieren dorënner blo Liichtjoer Bestrahlungen a chemesche Sonden, a kee groussen cytotoxicity war observéiert (Ergänzlech Lalumi 4a).
Fir d'Etikettéierungsmechanismus ze studéieren an d'proteomesch Identifikatioun vu Proteinkomplexe mat LC-MS / MS z'erméiglechen, musse mir als éischt bestëmmen wéi eng Aminosäuren geännert ginn an d'Delta Mass vun Sondeetiketten.Methionin, Histidin, Tryptophan an Tyrosin goufen gemellt duerch Singlet Sauerstoff14,15 geännert ze ginn.Mir integréieren den TOP-ABPP31 Workflow mat der onparteilecher oppener Sich, déi vun der FragPipe Rechenplattform baséiert op MSFragger32.No Singlet Sauerstoff Modifikatioun a chemesch Sonde Etikettéierung, gouf Klickchemie mat engem Biotin Reduktioun Label mat engem cleavable Linker ausgefouert, gefollegt vun Neutravidin Stretching an Trypsin Verdauung.D'modifizéiert peptide, nach un der resin gebonnen, war photocleaved fir LC-MS /MS Analyse (Dorënner 2a an Zousaz Donnéeën 1).Eng grouss Zuel vun Ännerungen geschitt uechter d'proteome mat iwwer 50 peptide Kaart (PSM) Mätscher opgezielt (Lalumi 2b).Iwwerraschend hu mir nëmmen d'Modifikatioun vum Histidin observéiert, wahrscheinlech wéinst der méi héijer Reaktivitéit vum oxidéierten Histidin géint Anilinsonde wéi aner Aminosäuren.Laut dem publizéierten Mechanismus vun der Histidinoxidatioun duerch Singlet Sauerstoff,21,33 entsprécht déi proposéiert Delta-Mass Struktur vun +229 Da dem Addukt vun der Sonde 3 mat 2-Oxo-Histidin no zwou Oxidatiounen, während +247 Da de Hydrolyseprodukt ass. vun +229 Da (Ergänzungsbild 5).D'Evaluatioun vun der MS2 Spektrum zougedréckt eng héich Zouverlässegkeet vun Identifikatioun vun meescht vun der y an b Ionen, dorënner d'Identifikatioun vun geännert Fragmenter Ionen (y an b) (Lalumi 2c).Kontext Analyse vun der lokal Haaptrei vun PDPL-geännert histidines verroden eng moderéiert Motiv Preferenze fir kleng hydrophobic Reschter um ± 1 Positiounen (Ergänzlech Lalumi 4b).Am Duerchschnëtt, 1,4 histidines sech pro Protein identifizéiert, an de Siten vun dëse lues sech duerch Léisungsmëttelbad zougänglech Uewerfläch (SASA) a relativ Léisungsmëttelbad Disponibilitéit (RSA) Analyse (Ergänzlech Lalumi 4c, d).
En onparteiesche Workflow fir d'Reschtselektivitéit ze studéieren mat der FragPipe Rechenplattform ugedriwwen vum MSFragger.Cleavable Linker ginn an der Click Chimie benotzt fir Photocleavage vu modifizéierten Peptiden aus Streptavidinharz z'erméiglechen.Eng oppe Sich gouf gestart fir vill Ännerungen ze identifizéieren, souwéi relevant Iwwerreschter.b Assignéiert d'Mass vun Ännerungen déi am ganze Proteom optrieden.Peptide Kartéierung PSM.c MS2 Spektral Annotatioun vun Histidinplazen, déi mat Sonde 3 geännert goufen. Als representativ Beispill huet eng kovalent Reaktioun mat Sonde 3 +229,0938 Da zu der modifizéierter Aminosaier bäigefüügt.d Mutatiounsassay benotzt fir PDPL Marker ze testen.PRDX3 (H155A, H225A) an PRDX1 (H10A, H81A, H169A) sech mat Wild-Typ plasmids fir Anti-Fändel erkennen transfected.e De syntheteschen Peptid gouf mat gereinegt MiniSOG an der Präsenz vun der Sonde 3 reagéiert an déi entspriechend Produkter mat Δm +247 an +229 goufen am LC-MS Spektrum bemierkt.f In vitro Protein-zu-Protein Interaktiounen modelléiert mat miniSOG-6xHis-Tag an Anti-6xHis Antikörper.Antibiotin (Streptavidin-HRP) an Anti-Maus Western Blot Analyse vu miniSOG-6xHis / Anti-6xHis Antikörperkomplexe mat Sonde 3 markéiert, ofhängeg vun der Zäit vun der Belaaschtung fir Liicht.Etikette fir eenzel Proteine ginn am entspriechende Molekulargewiicht ausgedréckt: LC Antikörper Liichtkette, HC Antikörper Schwéierkette.Dës Experimenter goufen onofhängeg op d'mannst zweemol mat ähnlechen Resultater widderholl.
Fir biochemical Verifizéierung vun der Etikettéierung Site, PRDX3 an PRDX1 duerch Mass spektrometrie identifizéiert goufen aus histidine zu alanine geännert a Verglach zu wëll Typ an transfection assays.D'PDPL Resultater weisen datt d'Mutatioun d'Etikettéierung wesentlech reduzéiert huet (Lalumi 2d).Mëttlerweil goufen d'Peptid-Sequenzen, déi an der oppener Sich identifizéiert goufen, synthetiséiert a reagéiert in vitro mat gereinegt MiniSOG an der Präsenz vun Sonde 3 a bloe Luucht, Produkter mat enger Masseverschiebung vun +247 an +229 Da wann se duerch LC-MS festgestallt ginn (Fig. .2e).).Fir ze testen ob interagéierend proximal Proteine in vitro als Äntwert op miniSOG Photoaktivéierung markéiert kënne ginn, hu mir eng kënschtlech Proximitéitsassay entworf duerch Interaktioun tëscht dem miniSOG-6xHis Protein an engem Anti-His monoclonal Antikörper in vitro (Figure 2f).An dësem Assay hu mir proximal Etikettéierung vun Antikörper schwéier a liicht Ketten mat miniSOG erwaart.Tatsächlech hunn d'Anti-Maus (déi schwéier a liicht Ketten vun Anti-6xHis-markéierten Antikörper erkannt) a Streptavidin Western Blots staark Biotinylatioun vun de schwéieren a liichte Ketten gewisen.Notamment hu mir miniSOG Autobiotinylatioun gemierkt wéinst dem 6xHis Tag a Kräizverbindunge tëscht liicht a schwéier Ketten, déi mat der virdru beschriwwener Spalt tëscht Lysin an 2-Oxo-Histidin proximal Äntwert verbonne sinn.Als Conclusioun schléissen mir datt PDPL Histidin an enger Proximitéit ofhängeg Manéier ännert.
Eist nächst Zil war de subcelluläre Proteom ze charakteriséieren fir d'Spezifizitéit vun der in situ Etikettéierung ze testen.Dofir hu mir miniSOG am Kär, der Mitochondrial Matrix oder baussenzegen ER Membran vun HEK293T Zellen stabil ausgedréckt (Fig. 3a).Gel fluorescence Analyse verroden vill Label Bands op dräi subcellular Plazen souwéi verschidde Etikette Musteren (Figebam. 3b).Fluoreszenz Imaging Analyse zougedréckt héich Spezifizitéit vun PDPL (Lalumi 3c).De PDPL-Workflow gouf gefollegt vu Klickreaktiounen mat Rhodamin-Faarwen fir subzellulär Proteome mat der Fluoreszenzmikroskopie ze markéieren, an PDPL-Signaler goufen mat DAPI, Mitochondrial Trackers oder ER Trackers kolokaliséiert, déi d'héich Vertrauen vu PDPL bestätegt.Fir déi dräi organelle Plazen, eng Säit-vun-Säit Verglach vun PDPL mat TurboID benotzt avidin westlechen blot gewisen, datt PDPL méi spezifesch am Verglach zu hire jeeweileg Kontrollen Label war.Ënner PDPL Konditiounen, méi markéiert Bands wossten, besot méi PDPL-Label Proteinen (Ergänzlech Lalumi 6a-d).
eng schematesch Representatioun vu miniSOG-mediéierten Organelle-spezifesche Proteome-Etikettéierung.miniSOG zielt d'Mitochondrial Matrix iwwer Fusioun op d'N-terminal 23 Aminosäuren vum mënschleche COX4 (mito-miniSOG), de Kär iwwer Fusioun op H2B (nucleus-miniSOG), an Sec61β iwwer d'zytoplasmatesch Säit vun der ER Membran (ER-miniSOG) ).Indikatiounen enthalen Gel Imaging, konfokal Imaging, a Massespektrometrie.b Representativ Gel Biller vun dräi organelle-spezifesch PDPL Profiler.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Vertrieder konfokal Biller vun HEK293T Zellen stabil ausdrécken miniSOG mat verschiddenen subcellulär Lokalisatiounen entdeckt duerch Antikörper markéiert V5 (rout).Subzellulär Marker gi fir Mitochondrien an ER (gréng) benotzt.De PDPL Workflow enthält d'Detektioun vu miniSOG (giel) markéierte subzelluläre Proteome mat Cy3-Azid Klickchemie.Skala Bar: 10 µm.d Vulkanesch Komplott vun PDPL-tagged proteomes a verschiddene organelles quantifizéiert duerch unlabeled quantification (n = 3 onofhängeg biologesch Experimenter).Zwee-tailed Student d'T-Test war op Vulkan Komplott benotzt.HEK293T wëll Typ war als negativ Kontroll benotzt. Bedeitend verännert Proteine ginn a rout markéiert (p <0,05 an> 2-fache Ionintensitéit Ënnerscheed). Bedeitend verännert Proteine ginn a rout markéiert (p <0,05 an> 2-fache Ionintensitéit Ënnerscheed). Значительно изменные белки выделены красным цветом (p < 0,05 an > 2-Kratnaя разница an der Intensivitéit). Bedeitend verännert Proteine ginn a rout markéiert (p <0,05 an> 2-fach Ënnerscheed an der Ionintensitéit).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 a > 2-кратная разница в ионной силе). Bedeitend verännert Proteine ginn a rout markéiert (p <0,05 an > 2-fach Ënnerscheed an der Ionescher Kraaft).Verwandte Proteine wichteg fir HEK293T-miniSOG awer net wichteg fir HEK293T ginn a gréng gewisen.e Analyse vun der Spezifizitéit vu proteomesche Datesätz aus Experimenter d.D'total Zuel vu statistesch signifikante Proteinen an all Organelle (rout a gréng Punkten) ass uewen markéiert.Histogramme weisen Proteinen lokaliséiert an Organelle baséiert op MitoCarta 3.0, GO Analyse an A. Ting et al.Leit.Separat Datesätz fir Mitochondrien, Kären an ER.Dës Experimenter goufen onofhängeg op d'mannst zweemol mat ähnlechen Resultater widderholl.Raw Daten ginn a Form vu Matière Datendateien zur Verfügung gestallt.
Encouragéiert vum Gel an Imaging Resultater, gouf Label-gratis Quantifikatioun benotzt der identifizéiert proteome an all Organelle ze quantifizéieren (Ergänzungsdaten 2).Untransfected HEK293T gouf als negativ Kontroll benotzt fir Hannergrondmarker ze subtrahéieren. Vulkan Komplott Analyse ugewisen bedeitend beräichert Proteinen (p <0,05 an> 2-fantastesch Ionintensitéit) souwéi Singleton Proteinen déi nëmmen am miniSOG-ausdrécklech Linnen präsent sinn (Figebam. 3d rout a gréng Punkten). Vulkan Komplott Analyse ugewisen bedeitend beräichert Proteinen (p <0,05 an> 2-fantastesch Ionintensitéit) souwéi Singleton Proteinen déi nëmmen am miniSOG-ausdrécklech Linnen präsent sinn (Figebam. 3d rout a gréng Punkten). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Vulkan Komplott Analyse weist bedeitend beräichert Proteinen (p <0,05 an> 2-fantastesch Ion Intensitéit) wéi och eenzel Proteinen déi nëmmen am miniSOG-ausdrécklech Linnen präsent sinn (Figebam. 3d, rout a gréng Punkten).火山图 分析 分析 显示 显着 富集 的 蛋白质 (p <0,05 和> 2 倍 强度 强度 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质火山图 分析 显示 显示 的 的 蛋白质 (p <0,05 和> 2 离子 离子 强度强度)))))))))))) Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Vulkan Komplott Analyse réischt bedeitend beräichert Proteinen (p <0,05 an> 2x ionesch Kraaft) souwéi eenzel Proteinen nëmmen präsent an der miniSOG Ausdrock Linn (rout a gréng Punkten an Lalumi 3d).Dës Donnéeën ze kombinéieren, identifizéiert mir 1364, 461, an 911 statistesch bedeitend nuklear, mitochondrial, an ER baussenzege Membran Proteinen, respektiv.Fir d'Genauegkeet vun organelle-lokaliséierter PDPL ze analyséieren, hu mir MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) Analyse benotzt, an A. Ting et al.eng Donnéeën set8 war fir Mitochondrien benotzt, Kär, an ER der organelle Spezifizitéit vun der entdeckt Proteinen ze Test, entspriechend enger Richtegkeet vun 73,4, 78,5, an 73,0% (Lalumi 3e).D'Spezifizitéit vum PDPL bestätegt datt PDPL en idealt Tool ass fir organellespezifesch Proteome z'identifizéieren.Notamment huet d'submitochondrial Analyse vun identifizéierten mitochondriale Proteinen gewisen datt de gefaange Proteom haaptsächlech an der Matrix an der banneschten Membran verdeelt gouf (226 respektiv 106), fir 91,7% (362) vun der Gesamtzuel vun identifizéierten Mitochondriale Proteinen auszemaachen.en héije Niveau vun PDPL war zousätzlech confirméiert (Ergänzlech Lalumi 7a).Ähnlech huet subnuklear Analyse gewisen datt de gefaange Proteome haaptsächlech am Kär, Nukleoplasma an Nukleolus verdeelt gouf (Ergänzungs Fig. 7b).Nuklear proteomic Analyse mat engem nuklear Lokalisatioun Signal peptide (3xNLS) zougedréckt ähnlech Genauegkeet zu der H2B Konstruktioun (Ergänzlech Lalumi 7c-h).Fir d'Spezifizitéit vum PDPL Marker ze bestëmmen, gouf nuklear Laminin A als méi diskret lokaliséiert POI7 Fal gewielt.PDPL identifizéiert 36 bedeitend beräichert Proteinen, vun deenen 12 Proteinen (30,0% dorënner Lamin A) gutt charakteriséiert Lamin A interagéieren Proteinen annotéiert vun der String Datebank waren, mat engem méi héije Prozentsaz wéi d'BioID Method (122 Proteinen) 28 vun 28. , 22,9 %) 7. Eis Methode identifizéiert manner Proteinen, méiglecherweis wéinst limitéierten Etikettéierungsberäicher, wat duerch méi aktive Singlet Sauerstoff méiglech gemaach gouf.GO Analyse huet gewisen datt déi identifizéiert Proteinen haaptsächlech am Nukleoplasma (26), Nuklearmembran (10), Nuklearmembran (9) an Nuklearporen (5) lokaliséiert goufen.Zesummen, dës nuklear-lokaliséiert Proteinen fir 80% vun der beräichert Proteinen ausgemaach, weider Beweiser der Spezifizitéit vun PDPL (Ergänzlech Lalumi 8a-d).
Nodeems d'Fäegkeet vum PDPL etabléiert ass fir Proximitéitsmarkéierung an Organellen ze maachen, hu mir dann getest ob PDPL benotzt ka ginn fir POI bindend Partner ze analyséieren.Besonnesch hu mir gesicht fir PDPL Analyse vun zytosolesche Proteinen ze definéieren, déi méi schwiereg Ziler ugesi ginn wéi hir Membran-lokaliséiert Géigeparteien wéinst hirer héich dynamescher Natur.De bromodomain an extraterminal (BET) Protein BRD4 huet eis Opmierksamkeet fir seng Schlësselroll bei verschiddene Krankheeten ugezunn 35, 36.De Komplex geformt vum BRD4 ass en transkriptionalen Koaktivator an e wichtegt therapeutescht Zil.Duerch d'Reguléierung vum Ausdrock vun c-myc a Wnt5a Transkriptiounsfaktoren, gëtt BRD4 als Schlësseldeterminant vun akuter myeloid Leukämie (AML), Multiple Myelom, Burkitt's Lymphom, Colonkrebs an entzündleche Krankheeten ugeholl37,38.Zousätzlech zielen e puer Viren BRD4 fir viral a cellulär Transkriptioun ze reguléieren, sou wéi Papillomavirus, HIV, a SARS-CoV-236,39.
Fir d'BRD4 Interaktioun mat PDPL ze kartéieren, hu mir miniSOG mat enger kuerzer N- oder C-terminal Isoform vu BRD4 kombinéiert.Proteomic Resultater verroden en héije Grad vun Iwwerlappung tëscht den zwee Konstruktiounen (Ergänzlech Lalumi 9a).D'nuklear proteome identifizéiert mat miniSOG-H2B deckt 77,6% vun de Proteinen interagéieren mat BRD4 (Ergänzlech Fig. 9b).Duerno goufen verschidden Zäiten vun der Beliichtung (2, 5, 10, 20 min) benotzt fir de Markerradius unzepassen (Fig. 4a an Ergänzungsdaten 3).Mir schléissen datt bei méi kuerzer Fotoperioden, PDPL haaptsächlech direkt Bindungspartner markéiert, während méi laang Perioden Proteine enthalen, déi während méi kuerzer Photoaktivéierungsperioden identifizéiert goufen, souwéi indirekt Ziler a Labelkomplexen.Tatsächlech hu mir staark Iwwerlappung tëscht Nopeschzäitpunkte fonnt (84,6% fir 2 a 5 min; 87,7% fir 5 an 10 min; 98,7% fir 10 an 20 min) (Lalumi 4b an Zousaz Lalumi 9c).An all experimentell Gruppen, hu mir net nëmmen BRD4 Self-Etikett fonnt, mä verschidde bekannt Ziler wéi MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, an HMGB1 an der String Datebank annotéiert.D'ionesch Stäerkt vun dësen Ziler ass proportional zu der Belaaschtungszäit (Fig. 4c an Zousaz Fig. 9d).GO Analyse vun de Proteinen identifizéiert an der 2-Minutt Grupp huet gewisen, datt d'identifizéiert Proteinen am Kär lokaliséiert goufen a sech an chromatin remodeling an RNS polymerase Funktioun Équipe.D'molekulare Funktioun vun der Protein war an chromatin bindend oder transcriptional coactivation beräichert, konsequent mat BRD4 Funktioun (Figebam. 4d).String Datebank-aktivéiert Protein Interaktioun Analyse huet en éischten Niveau vun indirekten Interaktiounen tëscht BRD4 an HDAC Famill interagéiert Komplexe wéi SIN3A, NCOR2, BCOR, an SAP130 (Fig. 4e an Ergänzungs Fig. 9e), konsequent mat BRD4 an HDAC bindend acetyléierten Histonen. ..Zousätzlech, representativ Ziler identifizéiert vun LC-MS /MS, dorënner Sin3A, NSUN2, Fus, an SFPQ, sech duerch Western blotting (Lalumi 4f) bestätegt.Viru kuerzem ass déi kuerz Isoform vu BRD4 gemellt ginn fir Käre mat Liquid-Liquid Phase Trennung (LLPS) Eegeschaften ze bilden.D'RNA bindend Proteinen Fus a SFPQ vermëttelen d'LLPS vu verschiddene celluläre Prozesser a goufen hei als onopgeholl BRD4 bindend Proteine identifizéiert.D'Interaktioun tëscht BRD4 an SFPQ gouf bestätegt duerch Co-Immunoprecipitatioun (Co-IP) Experimenter (Figure 4g), suggeréiert en anere Mechanismus fir BRD4-vermittelte Flësseg-Flësseg Phase Trennung déi weider Enquête verdéngt.Zesummegefaasst suggeréieren dës Resultater datt PDPL eng ideal Plattform ass fir bekannte BRD4 interagéierend wéi och onbekannt bindend Proteinen z'identifizéieren.
eng schematesch Representatioun vu miniSOG-mediéierten BRD4 Proximitéitsmarkéierung, Beliichtungszäiten: 2, 5, 10 an 20 min.b Iwwerlappung vu Proteinen identifizéiert bei verschiddene Beliichtungszäiten.Protein Beräicherung identifizéiert an HEK293T-miniSOG-BRD4 war statistesch bedeitend am Verglach zu Wild-Typ HEK293T.c Ionintensitéit beim quantifizéieren unlabeled representativ bekannte BRD4-bindende Proteinen während der spezifizéierter Beliichtungszäit.n = 3 biologesch onofhängeg Echantillon.Daten ginn als mëttler ± Standarddeviatioun presentéiert.d Gene ontologesch Analyse (GO) vu Proteinen, déi an der 2-Minute Grupp identifizéiert goufen.Déi éischt zéng GO Begrëffer sinn opgezielt.Bubbles si faarweg no der GO Begrëff Kategorie, a Bubble Gréisst ass proportional zu der Unzuel vun Proteinen an all Begrëff fonnt.e String Analyse vu Proteinen déi mat BRD4 interagéieren.Déi giel Kreeser sinn direkt Klebstoff an déi gro Kreeser sinn déi éischt Schicht vum indirekte Klebstoff.Déi rout Linnen representéieren déi experimentell bestëmmten Interaktiounen an déi blo Linnen representéieren déi virausgesot Interaktiounen.f Vertrieder BRD4 bindend Ziler am LC-MS /MS identifizéiert goufen duerch Western blotting verifizéiert.g Co-immunoprecipitation Experimenter confirméieren d'Interaktioun tëscht SFPQ an BRD4.Dës Experimenter goufen onofhängeg op d'mannst zweemol mat ähnlechen Resultater widderholl.Raw Daten ginn a Form vu Matière Datendateien zur Verfügung gestallt.
Zousätzlech fir onregistréiert POI-assoziéiert Ziler z'identifizéieren, hu mir hypothetiséiert datt PDPL gëeegent ass fir Substrate fir Enzymen z'identifizéieren, wat d'Charakteriséierung vun indirekten verbindlechen Proteinen a grousse Komplexe erfuerdert fir onregistréiert Substrate ze annotéieren.Parkin (kodéiert vu PARK2) ass eng E3 Ligase a Mutatiounen am Parkin si bekannt fir autosomal recessive juvenile Parkinson Krankheet (AR-JP)42 ze verursaachen.Zousätzlech gouf Parkin als essentiell fir Mitophagie beschriwwen (mitochondrial Autophagie) an d'Entfernung vu reaktive Sauerstoffaarten.Wéi och ëmmer, obwuel verschidde Parkin Substrate identifizéiert goufen, bleift d'Roll vum Parkin an dëser Krankheet onkloer.Fir seng oncharakteriséiert Substrate ze annotéieren, gouf PDPL getest andeems MiniSOG op den N- oder C-Terminus vum Parkin bäigefüügt gouf.Zellen goufen mat der Carbonyl Cyanid Proton Transporter m-Chlorphenylhydrazon (CCCP) behandelt Parkin via de PINK1-Parkin Wee ze aktivéieren.Am Verglach mat eise BRD4 PDPL Resultater, Parkin N-Terminus Fusioun huet e gréissere Set vun Zilproteinen opgedeckt, obwuel et e méi groussen Deel vum C-Terminus (177 vun 210) ofgedeckt huet (Dorënner 5a, b an Zousazdaten 4).d'Resultat ass konsequent mat Berichter datt N-Terminal Tags Parkin44 aberrant aktivéiere kënnen.Iwwerraschend waren et nëmmen 18 iwwerlappend Proteinen an eisen Daten mat publizéierten AP-MS Resultater fir Parkin43, méiglecherweis wéinst Differenzen tëscht Zelllinnen a Proteomics Workflows.Zousätzlech zu véier bekannte Proteinen (ARDM1, HSPA8, PSMD14, an PSMC3) identifizéiert vun zwou Methoden (Lalumi 5c) 43.Fir d'Resultater vun LC-MS /MS weider ze validéieren, PDPL Behandlung a spéider Western blotting goufen benotzt d'Resultater vun der HEK293T Elterendeel Zell assay an der stabil N-terminal Parkin Linn ze vergläichen.Virdrun onbekannt Ziler CDK2, DUT, CTBP1, an PSMC4 sech mat engem bekannte Binder, DNAJB1 (Lalumi 5d) getest.
Vulkan Komplott vu Parkin-interagéierende Proteinen an HEK293T Zellen mat stabil ausgedréckte MiniSOG fusionéiert un den N- oder C-Terminus vum Parkin (n = 3 onofhängeg biologesch Experimenter).Zwee-tailed Student d'T-Test war op Vulkan Komplott benotzt.HEK293T war als negativ Kontroll benotzt. Bedeitend verännert Proteine ginn a rout markéiert (p <0,05 an> 2-fache Ionintensitéit Ënnerscheed). Bedeitend verännert Proteine ginn a rout markéiert (p <0,05 an> 2-fache Ionintensitéit Ënnerscheed). Значительно изменные белки выделены красным цветом (p < 0,05 an > 2-Kratnaя разница an der Intensivitéit). Bedeitend verännert Proteine ginn a rout markéiert (p <0,05 an> 2-fach Ënnerscheed an der Ionintensitéit).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 a > 2-кратная разница в ионной силе). Bedeitend verännert Proteine ginn a rout markéiert (p <0,05 an > 2-fach Ënnerscheed an der Ionescher Kraaft).Verwandte Proteine wichteg fir HEK293T-miniSOG awer net wichteg fir HEK293T ginn a gréng gewisen.b Venn Diagramm weist iwwerlappend Proteinen tëscht N-terminal an C-terminal Konstruktiounen.N-Terminal Tags kënnen Parkin aberrant aktivéieren an zu méi erkennbar Proteine Resultat.c Venn Diagramm weist iwwerlappend Proteinen tëscht PDPL an AP-MS.Bekannt Interaktore sinn opgezielt, dorënner 4 vun 18 iwwerlappende Proteinen an 11 vun 159 Proteine spezifesch am PDPL identifizéiert.d Vertrieder vun LC-MS /MS identifizéiert Ziler sech duerch Western blotting verifizéiert.e Ssu72 an SNW1 goufen als onregistréiert Parkin Substrater identifizéiert.Dës FLAG-tagged Proteinplasmide goufen an HEK293T an HEK293T-Parkin-miniSOG transfektéiert, gefollegt vun der CCCP Behandlung op verschidden Zäitpunkten.D'Degradatioun war méi ausgeschwat an der Parkin Iwwerexpressiounslinn.f Mat Hëllef vum Proteasom-Inhibitor MG132 gouf bestätegt datt den Degradatiounsprozess vu Ssu72 an SNW1 duerch Proteasom-Ubiquitinatioun vermëttelt gëtt.Dës Experimenter goufen onofhängeg op d'mannst zweemol mat ähnlechen Resultater widderholl.Raw Daten ginn a Form vu Matière Datendateien zur Verfügung gestallt.
Notamment mussen d'Proteine identifizéiert vun PDPL Parkin-bindende Proteinen an hir Substrate enthalen.Fir onregistréiert Parkin Substrater z'entdecken, hu mir siwen identifizéiert Proteinen ausgewielt (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 an SNW1) an transfektéiert Plasmiden fir dës Genen op normal HEK293T auszesetzen a stabil auszedrécken miniSOG-Parkin's Behandlung gefollegt vun HEK293T.D'Niveaue vun Ssu72 an SNW1 Proteinen sech däitlech reduzéiert an der stabil miniSOG-Parkin Linn (Lalumi 5e).D'Behandlung mat CCCP fir 12 Stonnen huet zu de bedeitendsten Degradatioun vu béide Substrate gefouert.Fir z'ënnersichen, ob d'Degradatioun vu Ssu72 an SNW1 duerch Proteasom-Ubiquitinatioun reglementéiert ass, gouf de Proteasom-Inhibitor MG132 bäigefüügt fir d'Proteasomaktivitéit ze hemmen, an tatsächlech hu mir festgestallt datt hiren Ofbauprozess inhibitéiert gouf (Figebam. 5f).Zousätzlech Net-Substrat Ziler goufen als Parkin Interaktoren mat Western blotting bestätegt (Ergänzlech Fig. 10), déi konsequent Resultater mat LC-MS /MS gewisen hunn.Als Conclusioun erlaabt d'Integratioun vum PDPL Workflow mat Zilprotein Transfektiounsverifizéierung d'Identifikatioun vun onregistréierten E3 Ligase Substrate.
Mir hunn eng gemeinsam Proximitéit Markéierungsplattform entwéckelt, déi Iech erlaabt Iech am Raum an Zäit interagéierend POIs z'identifizéieren.D'Plattform baséiert op dem miniSOG Photosensibilisator Protein, deen nëmmen ongeféier 12 kDa ass, manner wéi d'Halschent vun der Gréisst vum reife APEX2 Enzym (27 kDa) an een Drëttel vun der Gréisst vum TurboID (35 kDa).Déi méi kleng Gréisst soll d'Palette vun Uwendungen fir d'Studie vu klenge Proteininteraktome staark ausbauen.Weider Exploratioun vun zousätzleche Fotosensibilisatoren, egal ob genetesch kodéiert Proteinen oder kleng Molekülen, ass néideg fir d'Quantenausbezuelung vum Singlet Sauerstoff ze erhéijen an d'Sensibilitéit vun dëser Approche auszebauen.Fir déi aktuell Versioun vum miniSOG kann eng héich temporär Opléisung mat der bloer Beliichtung erreecht ginn fir Proximitéitsmarker ze aktivéieren.Zousätzlech huet méi laang Belaaschtungszäit eng méi grouss "Wollek" vu Singlet Sauerstoff verëffentlecht, wat zu enger Modifikatioun vu méi distale Histidinreschter resultéiert, erhéicht Etikettéierungsradius an d'Fäegkeet fir d'PDPL raimlech Opléisung ze feinstemmen.Mir hunn och siwe chemesch Sonden getest fir de Signal-zu-Hannergrond Verhältnis ze erhéijen an de molekulare Mechanismus hannert dëser Approche exploréiert.Den TOP-ABPP Workflow kombinéiert mat onbestëmmten oppene Sich bestätegt datt Ännerungen nëmmen an Histidine geschitt sinn a kee konsequent Mikroëmfeld gouf fir erhéicht Histidin Modifikatioune beobachtet, ausser eng moderéiert Präferenz fir Histidinen an der Loopregioun.
PDPL gouf och benotzt fir subcellulär Proteome mat Proteome Spezifizitéit an Ofdeckung op d'mannst vergläichbar mat anere Proximitéitsetiketten an organellespezifesche chemesche Sondemethoden ze charakteriséieren.Proximitéitsmarker goufen och erfollegräich benotzt fir d'Uewerfläch, lysosomal a secretome-assoziéiert Proteome46,47 ze charakteriséieren.Mir gleewen datt PDPL mat dësen subcelluläre Organellen kompatibel ass.Zousätzlech hu mir PDPL erausgefuerdert andeems mir Ziler fir zytosolesch Proteinbindung identifizéieren déi méi komplex sinn wéi Membran gebonnen Proteinen wéinst hiren dynamesche Eegeschaften an Engagement a méi temporär Interaktiounen.PDPL war op zwee Proteinen applizéiert, der transcriptional coactivator BRD4 an der Krankheet-assoziéiert Ligase E3 Parkin.Dës zwee Proteine goufen net nëmme fir hir fundamental biologesch Funktiounen gewielt, awer och fir hir klinesch Relevanz an therapeutesch Potenzial.Fir dës zwee POIs goufen bekannte Bindungspartner wéi och onregistréiert Ziler identifizéiert.Notamment gouf d'Phase-Trennung-assoziéiert Protein SFPQ duerch Co-IP bestätegt, wat en neie Mechanismus uginn kann, duerch deen BRD4 (kuerz Isoform) LLPS reguléiert.Zur selwechter Zäit gleewen mir datt d'Identifikatioun vu Parkin Substrate e Szenario ass an deem d'Identifikatioun vun indirekten Klebstoff erfuerderlech ass.Mir identifizéiert zwee onidentifizéierte Parkin Substrate a bestätegt hir Degradatioun laanscht den Ubiquitinatiouns-Proteasomwee.Viru kuerzem ass eng Mechanismus-baséiert Trappstrategie entwéckelt ginn fir Hydrolase-Substrate z'entdecken andeems se se mat Enzymen ophalen.Och wann dëst eng ganz mächteg Method ass, ass et net gëeegent fir d'Analyse vu Substrate, déi an der Bildung vu grousse Komplexe involvéiert sinn, a erfuerdert d'Bildung vu kovalente Bindungen tëscht dem Enzym an dem Substrat.Mir erwaarden datt PDPL verlängert ka ginn fir aner Proteinkomplexen an Enzymfamilljen ze studéieren, sou wéi d'Deubiquitinase a Metalloprotease Famillen.
Eng nei Form vu miniSOG, genannt SOPP3, gouf mat verbesserte Singlet Sauerstoffproduktioun entwéckelt.Mir verglach miniSOG mat SOPP3 a fonnt verbessert Marquage Leeschtung, obwuel d'Signal-ze-Geräischer Verhältnis onverännert bliwwen (Ergänzungsbild 11).Mir hunn hypothetiséiert datt d'Optimiséierung vu SOPP3 (zB duerch geriicht Evolutioun) zu méi effiziente Fotosensibilisatorproteine féiere wäert, déi méi kuerz Liichtzäiten erfuerderen an doduerch méi dynamesch cellulär Prozesser erfaasse kënnen.Notamment ass déi aktuell Versioun vum PDPL limitéiert op dat cellulärt Ëmfeld well et blo Liichtbeliichtung erfuerdert a kann net déif Stoffer penetréieren.Dës Feature verhënnert seng Benotzung an Déiermodellstudien.Wéi och ëmmer, d'Kombinatioun vun Optogenetik mat PDPL kéint eng Chance fir Déierefuerschung ubidden, besonnesch am Gehir.Zousätzlech, aner manipuléiert Infrarout Fotosensibilisatoren och dës Begrenzung ewechzehuelen.Fuerschung ass amgaang an dësem Beräich.
D'HEK293T Zell Linn war vun ATCC (CRL-3216) kritt.D'Zelllinn getest negativ fir mycoplasma Wonn a war an DMEM cultured (Thermo, #C11995500BT) ergänzt mat 10% Fetal Bovine serum (FBS, Vistech, #SE100-B) an 1% Penicillin /streptomycin (Hyclone, #SV30010).gewuess an.
3-Aminophenylene (Prouf 3) an (4-ethynylphenyl) methanamine (Prouf 4) goufen aus Bidepharm kaaft.Propylamine (Sonde 2) gouf vun Energiechemikalien kaaft.N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamid (Sonde 1) gouf no publizéierte Methoden synthetiséiert.
Ergänzungstabelle 1 lëscht déi genetesch Konstrukter déi an dëser Etude benotzt goufen.D'miniSOG a KillerRed Sequenzen goufen aus engem Kaddoplasmid vu P. Zou (Peking University) gekloont.D'mitochondrial Matrixentgasung Sequenz war vun der 23 N-terminal Aminosaier Saieren vun COX4 ofgeleet an an déi uginn Vecteure gekloont mat enger Gibson Assemblée (Beyotime, #D7010S).Fir d'Membran an de Kär vum endoplasmatesche Retikulum ze zielen, SEC61B mënschlech DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) verstäerkt duerch PCR aus enger cDNA Bibliothéik vun HEK293T Zellen, an H2B DNA (gesenkt vum D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) a gekloont , wéi uewen ernimmt.Wann net anescht uginn, aner Protein Genen fir transfection a Bau vun stabil Zell Linnen benotzt goufen PCR aus der HEK293T Zell cDNA Bibliothéik amplifizéiert.G3S (GGGS) an G4S (GGGGS) goufen als Linker tëscht der Köder Protein an miniSOG benotzt.E V5 Epitop Tag (GKPIPNPLLGLDST) gouf zu dëse Fusiounskonstruktioune bäigefüügt.Fir Ausdrock an Mamendéieren an eng stabil Zell Linn ze etabléieren, gouf de miniSOG Fusioun Konstruktioun an de pLX304 lentiviral Vecteure subcloned.Fir bakteriell Ausdrock, miniSOG war an der pET21a Vecteure gekloont 6xHis um C-terminus Label.
HEK293T Zellen goufen bei 2.0 x 105 Zellen pro Well a sechs-Well Placke gesaat a 24 Stonnen méi spéit transfektéiert mat rekombinante lentiviral Plasmiden (2.4 μg pLX304) a virale Verpackungsplasmiden (1.5 μg psPAX2 an 1.2 μg psPAX2 an 1.2 μg mat Lip0yo) benotzt (MidBeoG) , #C0533), ongeféier 80% Fusioun.No Iwwernuechtungstransfektioun gouf de Medium geännert a fir eng aner 24 Stonnen inkubéiert.D'Sammlung vum Virus gouf no 24, 48 an 72 Stonnen duerchgefouert.Virun der Infektioun vun den Zilzelllinnen gouf de virale Medium duerch en 0,8 μm Filter (Merck, #millex-GP) gefiltert a Polybrene (Solarbio, #H8761) gouf zu enger Konzentratioun vun 8 μg /ml bäigefüügt.No 24 Stonnen konnten d'Zellen sech erholen andeems de Medium geännert gëtt.Zellen sech mat 5 μg /ml blasticidin (Solarbio, # 3513-03-9) fir déi éischt dräi Passagen als niddereg streng Auswiel ausgewielt.Duerno benotzt 20 μg / ml als méi streng Regime fir déi nächst dräi Passagen.
Zellen goufen an 12-Well Chambers gesaat (Ibidi, #81201) bei enger Dicht vun ongeféier 20.000 Zellen pro gutt.Fir d'Adhäsioun vun HEK293T Zellen ze verbesseren, add 50 µg / ml Fibronectin (Corning, #356008) verdünnt a phosphatgebufferter Salzlinn (PBS, Sangon, #B640435) bei 37 ° C.D'Kammere goufen 1 Stonn virbehandelt an duerno mat PBS geläscht.No 24 Stonnen goufen d'Zellen eemol mat PBS gewäsch, inkubéiert mat 1 mM Sonde 3 a frësch Hanks 'equilibréierte Salzléisung (HBSS, Gibco, #14025092) fir 1 Stonn bei 37 ° C, an duerno mat enger bloer LED (460 nm) inkubéiert ).) goufen 10 min bei Raumtemperatur bestrahlt.Duerno goufen d'Zellen zweemol mat PBS gewäsch a mat 4% Formaldehyd an PBS (Sangon, #E672002) fir 15 Minutten bei Raumtemperatur fixéiert.Iwwerschoss Formaldehyd gouf aus fixen Zellen geläscht andeems se dräimol mat PBS wäschen.Zellen goufen dann mat 0,5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) an PBS permeabilized an 3 Mol mat PBS gewäsch.Dann huelt d'Kammer ewech a füügt un all Probe 25 μl vun enger Klickreaktiounsmëschung mat 50 μM Cy3-Azid (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) . an 0,5 mg /ml Natrium ascorbate (Aladdin, Nr. S105024) an incubated fir 30 Minutten bei Raumtemperatur.No enger Schnappreaktioun goufen d'Zellen sechs Mol mat PBS mat 0,05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) gewäsch an duerno mat 5% BSA (Abcone, #B24726) an PBST fir 30 Minutten bei Raumtemperatur blockéiert.
Fir colocalization immunostaining, Zellen sech mat Primärschoul antibodies no der uginn Konditiounen incubated: Maus anti-V5 Tag mAb (1:500, CST, #80076), Kanéngchen anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), Kanéngchen polyclonal Anti-Calnexin Antikörper (1:500, Abcam, #ab22595) oder Kanéngchen Anti-Lamin A/C monoklonal Antikörper (1:500; CST, #2032) bei 4 °C iwwer Nuecht.Nom 3 Mol mat PBST wäschen, goufen Zellen mat sekundären Antikörper inkubéiert: Geess Anti-Kanéngchen Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) verdünnt 1:1000, Geess Anti-Maus Alexa Fluor 594 (CST, #8889) verdünnt 1:1000.Verdünnung Verdünnt bei Raumtemperatur fir 30 Minutten.Zellen goufen dann 3 Mol mat PBST gewäsch an counterstained mat DAPI (Thermo, # D1306) an PBS fir 10 Minutten bei Raumtemperatur.No 3 Wäschen mat PBS goufen d'Zellen an 50% Glycerin (Sangon, #A600232) an PBS fir Imaging versiegelt.Immunofluorescent Biller goufen mat engem ZEISS LSM 900 Airyscan2 konfokalem Mikroskop an ZNE 3.5 Software kritt.
Fir Singlet Sauerstoff fluorescent Imaging, goufen Zellen zweemol mat Hanks HEPES Prellbock gewäsch ier 100 nM Si-DMA zu Hanks HEPES Prellbock (DOJINDO, #MT05).No der Belaaschtung vum Liicht goufen d'Zellen an engem CO2-Inkubator bei 37 ° C fir 45 Minutten inkubéiert.Zellen goufen dann zweemol mat Hanks 'HEPES Prellbock gewäsch a mat Hoechst am Hanks' HEPES Puffer fir 10 Minutten bei Raumtemperatur counterstained a visualiséiert mat engem ZEISS LSM 900 konfokalem Mikroskop., #M36008) am HBSS-Puffer mat Kalzium a Magnesium.No der Belaaschtung vu Liicht oder Doxorubicin (MCE, #HY-15142A), goufen d'Zellen an engem CO2-Inkubator bei 37 ° C. fir 10 Minutten inkubéiert, zweemol mat HBSS-Puffer gewäsch a mat Hoechst an HBSS-Puffer bei Raumtemperatur inkubéiert.Minutten.Doxorubicin war als positiv Sonde Kontroll benotzt wou Zellen mat 20 μM doxorubicin an HBSS mat 1% BSA fir 30 min behandelt goufen.Immunofluorescent Biller goufen mat engem Zeiss LSM 900 konfokalem Mikroskop kritt.
HEK293T Zellen, déi stabil Mito-miniSOG ausdrécken, goufen an enger Dicht vu ongeféier 30% an 15 cm Platen gesaat.No 48 Stonnen, wann ~ 80% Zesummefloss erreecht gouf, goufen d'Zellen eemol mat PBS gewäsch, mat 1 mM Sonde 3 a frësche HBSS Puffer inkubéiert fir 1 Stonn bei 37 ° C an dann mat enger bloer LED fir 10 Minutten am Raum beliicht. Temperatur..Duerno goufen d'Zellen zweemol mat PBS gewäsch, geschrauft a resuspendéiert an äiskale PBS-Puffer mat EDTA-fräie Protease-Inhibitoren (MCE, #HY-K0011).Zellen goufen lyséiert andeems de Tipp fir 1 Minutt sonikéiert gëtt (1 Sekonn op an 1 Sekonn aus bei 35% Amplitude).Déi resultéierend Mëschung gouf bei 15.871 xg fir 10 min bei 4 ° C centrifugéiert fir Schutt ze entfernen, an d'Supernatant Konzentratioun gouf op 4 mg / ml mat engem BCA Protein Assay Kit (Beyotime, #P0009) ugepasst.Kombinéiert 1 ml vum uewe genannte Lysat mat 0,1 mM photodegradéierbar Biotinazid (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM TBTA Ligand (Aladdin, #T162437), an 1 mM CuSO4 Inkubator mat Bottom Rotatioun fir 1 Stonn bei Raumtemperatur.No enger Schnappreaktioun füügt d'Mëschung an d'pre-gemëschte Léisung (MeOH: CHCl3: H2O = 4 ml: 1 ml: 3 ml) an engem 10 ml Glas Fläsch.D'Proben goufen gemëscht an centrifugéiert bei 4500 g fir 10 Minutten bei Raumtemperatur.Déi ënnescht an iewescht Léisunge goufen verworf, de Nidderschlag gouf zweemol mat 1 ml Methanol gewascht an 5 Minutte bei 4 ° C bei 15871 × g centrifugéiert.Füügt 1 ml 8 M Harnstoff (Aladdin, Nr. U111902) a 25 mM Ammoniumbikarbonat (ABC, Aladdin, Nr. A110539) fir de Nidderschlag opzeléisen.Echantillon goufen rekonstituéiert mat 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 an 25 mM ABC) fir 40 Minutten bei 55 ° C gefollegt vun der Zousätzlech vun 15 mM frësch iodoacetamide (Sangon, # A600539) bei Raumtemperatur am Däischteren.Alkylatioun bannent 30 Minutten..Eng zousätzlech 5 mM Dithiothreitol gouf bäigefüügt fir d'Reaktioun ze stoppen.Bereet ongeféier 100 μl NeutrAvidin Agarose Perlen (Thermo, #29202) fir all Probe vir, andeems Dir 3 Mol mat 1 ml PBS wäscht.Déi uewe genannte Proteomeléisung gouf mat 5 ml PBS verdünnt a mat virgewäschen NeutrAvidin Agarose-Pärelen fir 4 Stonnen bei Raumtemperatur inkubéiert.D'Pärelen goufen dann 3 Mol mat 5 ml PBS mat 0,2% SDS (Sangon, #A600485) gewäsch, 3 Mol mat 5 ml PBS mat 1M Harnstoff, an 3 Mol mat 5 ml ddH2O.D'Pärelen goufen dunn duerch Zentrifugéierung gesammelt an an 200 μl 25 mM ABC mat 1 M Harnstoff, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) an 20 ng /μl Trypsin (Promega, #V5280) resuspendéiert.Trypsinize iwwer Nuecht bei 37 ° C mat Rotatioun.D'Reaktioun gouf gestoppt andeems Miersäure (Thermo, # A117-50) derbäigesat gouf bis de pH 2-3 erreecht.D'Kärelen goufen 3 Mol mat 1 ml PBS mat 0,2% SDS gewäsch, 3 Mol mat 1 ml PBS mat 1 M Harnstoff, an dann 3 Mol mat 1 ml destilléiert Waasser.Déi modifizéiert Peptiden goufen duerch liicht Lysis (365 nm) fir 90 min mat 200 μl vu 70% MeOH verëffentlecht.No der Zentrifugéierung gouf de Supernatant gesammelt.D'Kärelen goufen dann eemol mat 100 μl 70% MeOH gewäsch an d'Supernatanten goufen zesummegefaasst.Echantillon goufen an engem Speedvac Vakuum Konzentrator gedréchent a bei -20 ° C bis Analyse gespäichert.
Fir Singlet Sauerstoff modifizéiert Peptiden z'identifizéieren an ze quantifizéieren, goufen d'Proben an 0,1% Mieresäure nei opgeléist an 1 μg Peptiden goufen analyséiert mat engem Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Massespektrometer ausgestatt mat enger Nano ESI Quell vun Tune an Xcalibur vu Verkeefer Software 4.3.Echantillon goufen op enger 75 µm × 15 cm intern gepackt capillary Kolonn mat 3 µm C18 Material (ReproSil-pur, #r13.b9.) getrennt a verbonne mat engem EASY-nLC 1200 UHPLC System (Thermo).D'Peptiden goufen duerch linear 95 Minutte Gradientchromatographie vun 8% Léisungsmëttel B bis 50% Léisungsmëttel B getrennt (A = 0,1% Mieresäure am Waasser, B = 0,1% Mieresäure an 80% Acetonitril), dann linear op 98% B min erhéicht. a 6 min bei engem Flowrate vun 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos sammelt Daten ofwiesselnd tëscht voller MS Scan an MS2 Scan ofhängeg vun den Daten.D'Sputterspannung gouf op 2,1 kV gesat an d'Temperatur vun der Iontransportkapillär war 320 °C.MS Spektrum (350-2000 m/z) goufen mat enger Resolutioun vun 120.000, AGC 4 × 105, an enger maximaler Inputzäit vun 150 ms gesammelt.Déi 10 am meeschte verbreet multiplizéierte Virgänger an all voller Scan goufen fragmentéiert mat HCD mat enger normaliséierter Kollisiounsenergie vun 30%, enger Quadrupol Isolatiounsfenster vun 1,6 m/z, an enger Resolutiounsastellung vun 30,000.En AGC Zil fir Tandem Massespektrometrie mat 5 × 104 a maximal Input Zäit 150 ms.Déi dynamesch Ausnam ass op 30 Sekonnen gesat. Net zougewisen Ionen oder déi mat enger Charge vun 1+ an >7+ goufen fir MS / MS verworf. Net zougewisen Ionen oder déi mat enger Charge vun 1+ an >7+ goufen fir MS / MS verworf. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены fir МС/МС. Net zougewisen Ionen oder Ionen mat enger Charge vun 1+ an> 7+ goufen fir MS /MS verworf.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ a >7+ были отклонены fir МС/МС. Onspezifizéierten Ionen oder Ionen mat Charge vun 1+ an> 7+ goufen fir MS / MS verworf.
Déi Matière Daten ginn mat der FragPipe Rechenplattform baséiert op MSFragger veraarbecht.Mass biases an entspriechend Aminosaier Saieren sech mat engem oppene Sich Algorithmus mat enger Virleefer Mass Toleranz vun -150 bis 500 Da bestëmmt.Modifizéiert Peptiden goufen duerno mat Histidin Modifikatioune mat Massegewënn vun +229.0964 an +247.1069 Da an PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo) identifizéiert.
Zellen, déi de verschmolzene miniSOG Gen stabil ausdrécken, goufen a 6 cm Platen gepflanzt.Beim Erreeche vun ~ 80% Zesummefloss goufen d'Zellen eemol mat HBSS (Gibco, #14025092) gewäsch, duerno mat chemesche Sonden an HBSS fir 1 Stonn bei 37 ° C inkubéiert a mat bloe Luucht beliicht.10W LED fir 20 Minutten bei Raumtemperatur.Fir ze bestëmmen wéi eng Zort vun reaktive Sauerstoffarten am PDPL involvéiert ass, 0,5 mM Vitamin C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 mM Mannitol (Energie Chemesch, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 goufen an d'Zellen als Ergänzunge bäigefüügt.No wäschen mat kale PBS, Zellen goufen geschrauft, gesammelt an 1,5 ml Zentrifuge Réier, an sonicated mat engem Tipp fir 1 min an 200 μl vun PBS mat 1x protease inhibitor ouni EDTA (1 s an 1 s ouni, Amplitude 35%).Déi resultéierend Mëschung gouf bei 15.871 × g fir 10 min bei 4 ° C centrifugéiert an d'Supernatant Konzentratioun gouf op 1 mg / ml mat engem BCA Protein Assay Kit ugepasst.Ongeféier 50 μl vun der uewen lysate war mat 0,1 mm Rhodamine Azid (Aladdin, Nr. T131368), 1 mm TCEP, 0,1 mm TBTA ligand, an 1 mm CuSO4 fir 1 Stonn bei Raumtemperatur mat Rotatioun vun ënnen no uewen incubated.No der Klickreaktioun gouf d'Nidderschlag mat Aceton duerchgefouert andeems 250 μl pre-gekillte Aceton op d'Proben bäigefüügt gouf, bei -20 ° C fir 20 min inkubéiert an 10 min bei 4 ° C bei 6010 × g centrifugéiert.Sammelt de Pellet a kachen an 50 μl 1x Laemmli's Puffer fir 10 min bei 95 ° C.Echantillon goufen dunn op SDS-PAGE laang Gelen analyséiert a visualiséiert mam Bio-rad ChemiDoc MP Touch Imaging System mat Image Lab Touch Software.
Ausdrock an Offäll vun der recombinant miniSOG-6xHis Protein war gesuergt wéi virdru beschriwwen.Kuerz, E. coli BL21 (DE3) Zellen (TransGen, # CD701-02) sech mat pET21a-miniSOG-6xHis transforméiert an Protein Ausdrock war mat 0,5 mm IPTG (Sangon, # A600168) entschlof.No Zell lysis, Proteinen sech mat Ni-NTA agarose Perlen (MCE, Nr. 70666) gereinegt, dialyzed géint PBS, a bei -80 ° C gespäichert.
Fir en Antikörper-baséiert In vitro Label Proximity Assay, mix 100 μM gereinegt miniSOG, 1 mM Sonde 3, an 1 μg Anti-Label Maus monoklonal Antikörper (TransGen, #HT501-01) an PBS zu engem Gesamtreaktiounsvolumen vun 50 μl..D'Reaktiounsmëschung gouf mat bloe LED-Liicht fir 0, 2, 5, 10 an 20 min bei Raumtemperatur bestrahlt.D'Mëschung gouf mat 0,1 mM Biotin-PEG3-Azid (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA Ligand, an 1 mM CuSO4 fir 1 h bei Raumtemperatur op engem Upward Motion Shaker inkubéiert.No enger Schnappreaktioun fügen se 4x Laemmli's Puffer direkt un d'Mëschung a kacht bei 95 ° C fir 10 min.Echantillon goufen op SDS-PAGE gels analyséiert an duerch westlech blotting mat streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068) analyséiert.
En histidinhaltege synthetescht Peptid mat C-terminal Amidatioun (LHDALDAK-CONH2) gouf benotzt fir d'nächst Peptid-baséiert In vitro Etikettéierung ze analyséieren.An dësem Assay goufen 100 μM gereinegt miniSOG, 10 mM Sonde 3 an 2 μg /ml synthetescht Peptid an PBS an engem Gesamtreaktiounsvolumen vu 50 μl gemëscht.D'Reaktiounsmëschung gouf mat bloe LED Luucht fir 1 Stonn bei Raumtemperatur bestrahlt.Ee Mikroliter Probe gouf analyséiert mat engem LC-MS System (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight Massespektrometer mat MassLynx Spektrum Analyse Software).
HEK293T Zellen, déi de miniSOG Fusiounsgen stabil ausdrécken, goufen an 10 cm Platen fir Linnen mat verschiddene Organelle Lokalisatioun (Mito, ER, Nucleus) an 15 cm Platen fir Parkin-miniSOG a BRD4-miniSOG Linnen gesaat.Beim Erreeche vun ~ 90% Zesummefloss goufen d'Zellen eemol mat HBSS gewäsch, duerno mat Sonde 3 an HBSS fir 1 Stonn bei 37 ° C inkubéiert a mat enger 10 W bloer LED bei Raumtemperatur beliicht.Fir net-kontakt Etikettéierung vun Parkin, 10 μM Proton Carbonyl Cyanid Träger m-chlorophenylhydrazon CCCP (Solarbio, #C6700) mat Sonde 3 an HBSS gouf fir 1 Stonn bei 37 ° C dobäi.D'Zell lysis, Klick Chimie, Reduktioun an alkylation Schrëtt waren déi selwecht wéi uewen beschriwwen, ausser dass 2 MG vun lysate dobäi an Biotin PEG3 Azid war am Klick Reaktioun amplaz photodegradable Biotin Azid benotzt.No Beräicherung goufen d'Kärelen 3 Mol mat 5 ml PBS mat 0,2% SDS gewäsch, 3 Mol mat 5 ml PBS mat 1 M Harnstoff an 3 Mol mat 5 ml PBS.Duerno gouf 2 μg Trypsin zu 300 μl 25 mM ABC mat 1 M Harnstoff bäigefüügt fir de Protein iwwer Nuecht bei 37 ° C ze spalten.D'Reaktioun gouf gestoppt andeems Miersäure bäigefüügt gouf bis e pH vun 2-3 erreecht gouf.No Trypsiniséierung op Perlen gouf d'Peptidléisung mat enger SOLAµ HRP Kolonn (Thermo, #60209-001) entsalt an an engem Speedvac Vakuumkonzentrator getrocknt.Peptiden goufen an 0,1% Mieresäure nei opgeléist a 500 ng Peptiden goufen analyséiert mat engem Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Massespektrometer mat der Nano-ESI Quell uewen beschriwwen.Peptiden goufen op kommerziell RP-HPLC Precolumns (75 μm x 2 cm) (Thermo, Nr. 164946) an analytesch RP-HPLC Sailen (75 μm x 25 cm) (Thermo, Nr. 164941) getrennt, allebéid mat 2 μm gefëllt.Gradient vun 8% bis 35% ACN an 60 Minutten, dann linear erop op 98% B an 6 Minutten bei engem Flux Taux vun 300 Nl / min.MS Spektrum (350-1500 m / z) goufen mat enger Resolutioun vun 60.000, AGC 4 × 105, an engem Maximum Input Zäit vun 50 ms gesammelt.Ausgewielt Ionen goufen sequenziell fragmentéiert vun HCD an 3 s Zyklen mat enger normaliséierter Kollisiounsenergie vun 30%, enger Quadrupole Isolatiounsfenster vun 1,6 m / z, an enger Resolutioun vun 15000. E 5 × 104 Tandem Massespektrometer AGC Zil an eng maximal Sprëtzzäit vun 22 ms benotzt goufen.Déi dynamesch Ausgrenzung ass op 45 Sekonnen gesat. Net zougewisen Ionen oder déi mat enger Charge vun 1+ an >7+ goufen fir MS / MS verworf. Net zougewisen Ionen oder déi mat enger Charge vun 1+ an >7+ goufen fir MS / MS verworf. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены fir МС/МС. Net zougewisen Ionen oder Ionen mat enger Charge vun 1+ an> 7+ goufen fir MS /MS verworf.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ a >7+ были отклонены fir МС/МС. Onspezifizéierten Ionen oder Ionen mat Charge vun 1+ an> 7+ goufen fir MS / MS verworf.
D'Probe Virbereedung Schrëtt bis op d'Beräicherung vun den NeutrAvidin Perlen waren déiselwecht wéi an der LC-MS /MS Analyse uewen beschriwwen.Ongeféier 50 μg Lysat gouf als Input fir Luede Kontroll benotzt an 2 mg Lysat gouf fir Klickreaktiounen benotzt.No Beräicherung a Wäschung mat Neutravidin, goufen déi gebonnen Proteine eluéiert andeems 50 μl Laemmli's Puffer an d'Agaroseharzpärelen bäigefüügt ginn a fir 5 Minutten bei 95 ° C kachen.Kontroll Laascht Input a Perle beräichert Echantillon sech duerch SDS-PAGE analyséiert an op PVDF Membranen (Millipore, #ISEQ00010) duerch Standard Western blot Methoden transferéierte.D'Membrane goufe mat 5% Mager Mëllech (Sangon, #A600669) an TBS mat 0,1% Tween-20 (TBST) blockéiert a sequentiell mat primären a sekundären Antikörper inkubéiert.Primär Antikörper goufen 1:1000 an 5% geschmëlzene Mëllech an TBST verdünnt an iwwer Nuecht bei 4 ° C inkubéiert.Sekundär Antikörper goufen an engem Verhältnis vun 1:5000 benotzt a fir 1 Stonn bei Raumtemperatur inkubéiert.D'Membranen goufen duerch Chemilumineszenz mam Chemidoc MP Imaging System visualiséiert.All ongeschniddene Scans vu Blots a Gelen an der Figur ginn als rau Daten presentéiert.
Primär Antikörper, déi an dëser Etude benotzt goufen, enthalen Kanéngchen anti-SFPQ monoclonal Antikörper (CST, Nr. 71992), Kanéngchen anti-FUS monoklonal Antikörper (CST, Nr. 67840), Kanéngchen Anti-NSUN2 polyklonal Antikörper (Proteintech, Nr. 20854-1) AP), Kanéngchen anti-mSin3A polyklonal Antikörper (Abcam, #ab3479), Maus Anti-Tag monoklonal Antikörper (TransGen, #HT201-02), Maus Anti-β-Actin monoklonal Antikörper (TransGen, #HC201-01), Kanéngchen Antikörper -CDK2 monoklonal Antikörper (ABclonal, #A0094), Kanéngchen monoklonal Antikörper géint CTBP1 (ABclonal, #A11600), Kanéngchen polyklonal Antikörper zu DUT (ABclonal, #A2901), Kanéngchen polyklonal Antikörper géint PS5, #ABrbital-Antikörper, #ABrbital-Antikörper DNAJB1 polyclonal Antikörper (ABclonal, # A5504).Dës Antikörper goufe bei enger 1:1000 Verdünnung an 5% Mager Mëllech an TBST benotzt.Déi sekundär Antikörper, déi an dëser Etude benotzt goufen, enthalen Anti-Kanéngchen IgG (TransGen, #HS101-01), Anti-Maus IgG (TransGen, #HS201-01) bei enger 1:5000 Verdünnung.
Fir weider z'ënnersichen ob BRD4 mat SFPQ interagéiert, stabil HEK293T a BRD4-miniSOG Zellen, déi HEK293T iwwerausdrécken, goufen an 10 cm Platen gepflanzt.Zellen sech mat kal PBS gewäsch an lysed an 1 ml Pierce IP lysis Prellbock (Thermo Fisher, #87787) mat EDTA-gratis protease inhibitor fir 30 Minutten bei 4 ° C.Duerno goufen d'Lysate an 1,5 ml Zentrifugeréier gesammelt a bei 15.871 xg fir 10 min bei 4 ° C centrifugéiert.D'supernatant war recoltéiert a mat 5 µg vun Anti-V5 Label Maus monoclonal antibody (CST, #80076) Iwwernuechtung bei 4 ° C incubated.Wash ongeféier 50 μl Protein A / G magnetesche Perlen (MCE, #HY-K0202) zweemol mat PBS mat 0,5% Tween-20.Duerno goufen d'Zelllysate mat magnetesche Perlen fir 4 Stonnen bei 4 ° C mat Rotatioun vun ënnen no uewen inkubéiert.Duerno goufen d'Kärelen véiermol mat 1 ml PBST-Puffer gewäsch a fir 5 min bei 95 ° C gekacht.Echantillon goufen op SDS-PAGE gels analyséiert an op PVDF Membranen mat Standard Western blot Methoden transferéiert.D'Membranen goufen an 5% geschniddener Mëllech an TBST blockéiert a sequentiell mat primären a sekundären Antikörper inkubéiert.Primär Antikörper Kanéngchen Anti-SFPQ monoclonal antibody (CST, #71992) war an engem Verhältnis vun 1:1000 an 5% liichtflüchtege Mëllech an TBST benotzt an iwwer Nuecht bei 4 ° C incubated.Anti-Kanéngchen IgG gouf an engem Verhältnis vun 1:5000 benotzt a fir 1 Stonn bei Raumtemperatur inkubéiert.D'Membranen goufen duerch Chemilumineszenz mam Chemidoc MP Imaging System visualiséiert.
All Strukture fir d'Solvent Accessible Surface Area (SASA) Analyse benotzt goufen aus der Protein Data Bank (PDB)52 oder der AlphaFold Protein Structure Database53 kritt.Absolut SASA gouf fir all Rescht berechent mam FreeSASA Programm.Nëmmen komplett an eendeiteg SASA Donnéeën fir markéiert Histidin a seng Noperen goufen benotzt der Moyenne SASA fir all Struktur ze kréien.D'relativ Léisungsmëttelzougänglechkeet (RSA) fir all Histidin gouf berechent andeems den absolute SASA-Wäert vun der empirescher maximal méiglecher Reschtfläch zur Léisungsmëttel verfügbar ass.All Histidine goufen dann als verstoppt klasséiert wann déi mëttler RSA ënner 20% war, soss exposéiert56.
Raw Dateien, déi am DDA-Modus kritt goufen, goufen duerch Proteome Discoverer (v2.5) oder MSfragger (Fragpipe v15.0) an der entspriechender SwissProt verifizéierter Protein-Datebank gesicht mat gemeinsame Verschmotzungen.D'Peptiden erfuerderen komplett Trypsin mat zwee fehlend Spaltplazen, Carbamoyl-Methylatioun als fixe Modifikatioun an Methionin-Oxidatioun als dynamesch Modifikatioun.Virleefer a Fragment Gewiicht Toleranzen sech op 10 ppm an 0,02 Da (MS2 Orbitrap) gesat. Kontaminant Hits goufen geläscht, a Proteinen goufen gefiltert fir eng falsch Entdeckungsquote vun <1% ze kréien. Kontaminant Hits goufen geläscht, a Proteinen goufen gefiltert fir eng falsch Entdeckungsquote vun <1% ze kréien. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэфициенты коэфициент 1%. Kontaminant Hits goufen ewechgeholl a Proteinen gefiltert fir e falschen Detektiounsquote vu <1% ze ginn.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1% 的错误发现率. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы fir достижения уровня ложных <1%. Kontaminant Hits goufen geläscht a Proteinen gefiltert fir e falschen positiven Taux vun <1% z'erreechen.Fir quantitativ Analyse ouni d'Benotzung vun Etiketten, normaliséierte Proteingehalt aus dräi biologesche Wiederholungen gouf benotzt.Protein subcellular Lokaliséierungsanalyse gouf mat der Gene Ontologie (GO) Analyse vun DAVID Bioinformatics Ressourcen, MitoCarta 3.0 an Datenbanken zesummegestallt a publizéiert vun der Alice Ting Grupp.De Vulkankaart gouf vum Perseus kritt (v1.6.15.0). Protein Heefegkeet falen Ännerungen sech fir statistesch Bedeitung mat engem zwee-dofir T-Test getest, a Protein Hits sech mat Iwwerfloss änneren> 2 identifizéiert (ausser anescht uginn) an p Wäert <0,05. Protein Heefegkeet falen Ännerungen sech fir statistesch Bedeitung mat engem zwee-dofir T-Test getest, a Protein Hits sech mat Iwwerfloss änneren> 2 identifizéiert (ausser anescht uginn) an p Wäert <0,05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Protein Inhalt klappt Ännerungen goufen fir statistesch Bedeitung mat engem zwee-tailed T-Test getest, a Protein Matcher goufen mat Inhalt änneren> 2 identifizéiert (ausser anescht uginn) an ap Wäert <0,05.E使用检验 检验 检验 检验 丰度 丰度 倍数 倍数 变化 变化 的 的 的 统计 统计 统计 显着性 显着性, 统计 蛋白质 蛋白质 和 和 和 和 <0 值 值) 和 <005.使用 检验 检验 检验 蛋白质 倍 倍 数 变化 变化 的 统计 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 和 和 和 和 <05. Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Statistesch Bedeitung vu falt Ännerungen am Proteingehalt gouf mat engem zwee-tailed T-Test getest, a Protein Matcher goufen fir Inhaltsverännerungen> 2 bestëmmt (ausser anescht uginn) a p-Wäerter <0,05.Protein Interaktioun Analyse gouf mat GO Analyse zesumme mat der String Datebank gemaach.
Dräi biologesch Replikate goufen mat ähnlechen Resultater duerchgefouert.Statistesch Analyse gouf mat GraphPad Prism (GraphPad Software) gemaach an Vulkanplots goufen mat Perseus (v1.6.15.0) generéiert.Fir déi zwou Gruppen ze vergläichen, goufen p-Wäerter mat engem zwee-tailed Student's t-Test bestëmmt.Nëmmen Singleton Proteinen, déi op d'mannst zweemol an der experimenteller Grupp identifizéiert goufen, goufen an de Vulkanplots abegraff, an déi entspriechend fehlend Wäerter an der Kontrollgruppe goufen duerch Perseus aus enger normaler Verdeelung ersat, sou datt de p-Wäert berechent ka ginn.Feeler Baren representéieren d'Moyenne ± Standarddeviatioun.Bei proteomeschen Analysen fir statistesch Analyse gouf d'Heefegkeet vu Proteinen, déi an op d'mannst zwee biologesche Replikate erschéngen, behalen.Statistesch Methode goufen net benotzt fir d'Proufgréisst ze bestëmmen.D'Experimenter sinn net zoufälleg.D'Fuerscher waren net blann fir d'Aufgaben während dem Experiment an der Evaluatioun vun de Resultater.
Fir méi Informatioun iwwer Studiedesign, kuckt den Nature Research Report Abstrakt verbonne mat dësem Artikel.
D'Massspektrometriedaten, déi an dëser Etude kritt goufen, goufen dem ProteomeXchange Consortium iwwer den iProX57 Partner Repository ënner Dataset ID PXD034811 (PDPL-MS Dataset) presentéiert.Raw Daten ginn a Form vu Matière Datendateien zur Verfügung gestallt.Dësen Artikel gëtt d'Original Donnéeën.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. D'Noperschaft kennen ze léieren: d'Proximitéit-ofhängeg Biotinylatioun ze benotzen fir Proteinkomplexen a Kaartorganellen ze charakteriséieren. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. D'Noperschaft kennen ze léieren: d'Proximitéit-ofhängeg Biotinylatioun ze benotzen fir Proteinkomplexen a Kaartorganellen ze charakteriséieren.Gingras, AS, Abe, KT a Raut, B. Bekanntheet mat der Ëmgéigend: Proximitéit-ofhängeg Biotinylatioun benotzt fir Proteinkomplexe a Kaartorganelle ze charakteriséieren. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. De Quartier verstoen: d'Ofhängegkeet vun der Noperschaft vum biologesche Liewen benotzen.Gingras, AS, Abe, KT a Raut, B. Verständnis vun der Proximitéit: Charakteriséierung vu Proteinkomplexen a Kartéierung vun Organellen mat der Proximitéit-ofhängeger Biotinylatioun.Aktuell.Meng Meenung.Chemesch.Biologie 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.Kartéiere vum Mikroëmfeld andeems Dir Dexter Energie op Immunzellen transferéiert.Science 367, 1091-1097 (2020).
Hertling, EL, et al.Zwee-Proteome Skala Netzwierker erkennen Zellspezifesch Remodeling vum mënschlechen Interaktom.Zellen 184, 3022-3040.e3028 (2021).
Post Zäit: Sep-15-2022
